IEF使用过程中常见问题及解决方法.docx

IEF使用过程中常见问题及解决方法 以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。 如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上。同时系统的电源供应会 在错误信息显示时自动切断。 问题  可能原因  解决方法 初始电流低或为零 ? IPG胶条与电极接触不好. ?检查IPG胶条与电极的接触情 况，确保聚焦槽的盖子正确地 合上. ? PROTEAN IEF等电聚焦仪与聚焦 盘电极接触不完全. ?检查聚焦盘的放置位置，确 保PROTEAN IEF等电聚焦仪与 聚焦盘电极正确接触. 在升压过程中电压不 上升. 电压未能达到预设电 压或达到极限电压过  ? IPG胶条水化不完全 ?确保IPG胶条完全并平均地进 行水化。检查水化液体积及水 化时间. ? 盐浓度过高 ?检查盐浓度并对样品进行除 盐处理. ? Bio-Lyte浓度过高 ? 将Bio-Lyte 浓度降至 0.2% (v/v). 程非常缓慢 对不同尺寸的IPG 胶条和pH梯度 电压设置过高. 过多的样品在水化过程中未能进 入胶条, 或IPG胶条因过多的样品 导致过度泡涨 在聚焦时请用伏小时进行编 程，以确保样品的完全聚 焦. 如果使用了超过了推荐的样 品体积量，确保所有样品能进 入胶条, 或在聚焦前除去多余 的样品液. 电压及电流波动很大. ? IPG胶条中有水化较差的区域, (同时电阻错误信息 或IPG 胶条在运行过程中已经烧干. 会显示)  ? 检查水化缓冲液体积及时间. 确保在水化期间水化缓冲液 平均地分配. ? 限流过高. ?建议限流50μA/胶条. 确保 输入正确的IPG胶条数目. 问题 可能原因 解决方法 烧胶条 (这将会导 致电阻较大的波动， 并引起电阻错误信 息显示.) ? 限流过高. ? 建议限流50μA/胶条. 确保输入 正确的IPG胶条数目. ? IPG 胶条已经烧干. ? 确保IPG胶条被矿物油或类似物 所覆盖以防止胶条烧干 电极处的滤纸过湿或含有不 合适的电极溶液. 水化缓冲液成份不合适, 盐 浓度过高.  确保滤纸电极只含有去离子水并 且处于润湿状态而非潮湿状态. 检查水化缓冲液浓度。必要时重 新配制缓冲液. 双向电泳实验中常见问题 一、水平条纹 出现的问题: 胶上出现连续性横纹。 可能的原因: 蛋白质没有完全和稳定溶解。 推荐解决的方法: ? ? ? 用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。因 此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e.g.CHAPS, ASB- 14），两性电解质和还原剂（DTT or TBP）非常重要。每一种 新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。为处理好样品， 现提供以下几个样品标准处理溶液： o 8–9 M urea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 Ampholyte o 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio- Lyte 3/10 Ampholyte 样品须有充分的溶解时间和变性时间。通常，在进行一相等电 聚焦前，须将样品水化液在室温平衡 1 小时左右。 进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（10,000 rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。 推荐产品: ReadyPrep protein extraction kit (total protein/全蛋白) 出现的问题: 出现不连续的横纹。 可能的原因: 样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂(SDS),肽类,核酸类 (e.g.DNA, RNA),脂类,多糖和酚类化合物。 推荐解决的方法:  以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅 Rabilloud （1996）. 盐：为确保 IEF 顺利完成,样品中的总盐类不得超过 40mM。样品中的盐 类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方 法减少或除去。蛋白质沉淀可以选用 10%TCA 丙酮处理 （Damerval et al. 1986）,也可选用 ReadyPrep 2-D cleanup kit。沉淀后，可以选 用 IEF/2-D 上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀 试剂完全去除。 阴离子去污剂：SDS 是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。 SDS 可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对 IEF 的影响。 但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时 就要注意其对样品的影响。如果在样品制备中