人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)酶联免疫分析试剂盒使用说明书.doc

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）酶联免疫分析试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平。用纯化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），再与HRP 标记的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存 说明书 1 份 1 份 封板膜 2 片（48） 2 片（96） 密封袋 1 个 1 个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存 标准品：45ng/L 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃保存 酶标试剂 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存 样品稀释液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存 显色剂A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存 显色剂B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存 终止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存 浓缩洗涤液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20 分钟，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞 2 浓度达到100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分 钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器 将标本匀浆充分。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二 孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl， 混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各 取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混 匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准 品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl， 浓度分别为30ng/L，20ng/L ，10 ng/L，5ng/L，2.5 ng/L）。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样 品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板