线粒体膜电位检测试剂盒jc-1.pdf

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)： 该试剂盒以 JC-1 为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化， 可用于早期的细胞凋亡检测。  JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位 ΔΨm 的理想荧光探针。可检测细胞、组织或 化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质中，形成聚合物， 可产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时 JC-1 为 单体，可产生绿色荧光。可非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常 用红、绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。  线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色 荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，也可作为细胞凋亡早期的检测指标。  JC-1 单体的最大激发波长为 514nm，最大发射波长为 529nm；JC-1 聚合物的最大激发 波长为 585nm，最大发射波长为 590nm。实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧 光的设置即可。  试剂盒提供了 CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。  对于六孔板中的样品，试剂盒总共可检测 100 个样品；对于 12 孔中的样品，试剂盒总共 可检测 200 个样品。 试剂准备 10mM CCCP ：将 1mg CCCP 溶解于 0.5mL DMSO 中，分装后-20℃保存。 使用说明： 1. JC-1 染色工作液的配制： 六孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量为 1mL，其它培养器皿的JC-1 染色工作液的用量 5 以此类推；对于细胞悬液每5~ 10×10 细胞需 0.5mL JC-1 染色工作液。取适量 JC-1(200×) ， 按照每 50μL JC-1(200×)加入 8mL 超纯水的比例稀释JC-1。剧烈Vortex 充分溶解并混匀JC-1。 然后再加入 2mL JC-1 染色缓冲液(5×) ，混匀后即为JC-1 染色工作液。 注意：JC-1 染色工作液配制的顺序不可颠倒，否则 JC-1 会很难充分溶解。 2. 阳性对照的设置： 推荐：将 10mM CCCP 按照 1:1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至 10μM，处理细 胞 20min 。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常 10μM CCCP 处理 20min 后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1 染色后观察应呈绿色荧光；而 正常的细胞经 JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时 间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。 3. 对于悬浮细胞： 5 ① 取 1~6×10 细胞，重悬于 0.5mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。 ② 加入 0.5mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min 。 ③ 在孵育期间，按照每 1mL JC-1 染色缓冲液(5×)加入 4mL 蒸馏水的比例，配制适量的 JC-1 1 染色缓冲液(1×) ，并放置于冰浴中。 ④ 37℃孵育结束后， 600g 4 ℃离心 3-4min ，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。 ⑤ 用 JC-1 染色缓冲液(1×)洗涤 2 次：加入 1mL JC-1 染色缓冲液(1×)重悬细胞，600g 4 ℃离 心 3-4min ，沉淀细胞，弃上清。再加入 1mL JC-1 染色缓冲液(1×)重悬细胞，600g 4 ℃离心 3-4min ，沉淀细胞，弃上清。 ⑥ 再用适量 JC-1 染色缓冲液(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以 用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。 4. 对于贴壁细胞： 注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可先收集细胞，重 悬后参考悬浮细胞的检测方法。 ① 对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液 洗涤细胞一次，加入 1mL 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。 ② 加入 1mL JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min