OverlapPCR克隆黄牛脂肪特异性磷脂酶A2基因(AdPLA)和其原核表达.pdf

农业生物技术学报，2011年，第 19卷，第6期，第 1051～1055页 JournalofAgriculturalBiotechnology，2011，Vo1．19，No．6，1051-1055 研究报告 ALetter OverlapPCR克隆黄牛脂肪特异性磷脂酶A2基因(AdPLA)及其原核 表达 朱金龙 孙晓梅 张亚 蓝贤勇 雷初朝 陈宏 西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100 通讯作者，chenhong1212@263．net 摘 要 脂肪特异性磷脂酶A2基因(adipose．specificphospholipaseA2，AdPLA)在脂肪组织甘油三酯水解过 程中发挥着重要的调节作用，为了构建黄牛AdPLA基因原核表达系统，本研究通过OverlapPCR方法从黄 牛(Bosto2．zrl~)基因组DNA中得到了AdPLA基因编码区全长，将其克隆到pGM—T载体上，阳性克隆经测序 表明，与NCBI公布的序yjl(GenBankNo．NM 001075280)完全一致。阳性质粒经BamHI和HindIII双酶切 后，将其定向重组到pET28a(+)原核表达载体上，转化感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中，用 IPTG诱导融合蛋 白表达。SDS．PAGE电泳表明，融合蛋 白His—AdPLA在大肠杆菌中表达，证明成功构建了 AdPLA基因原核表达系统，为进一步研究黄牛AdPLA基因的功能和AdPLA蛋 白产品开发提供了依据。 关键词 黄牛，脂肪特异性磷脂酶A2基因 dPLA)，原核表达，OverlapPCR CloningofCattleAdipose—specificphospholipaseA2Gene dPLA)by OverlapPCRandItsProkaryoticExpression ZhuJinlong SunXiaomei ZhangYa LanXianyong LeiChuzhao ChenHong’ CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestAgricuturalnadForestryUniversity,ShaanxiKeyLaboratory ofMolecularBioloyg for Agnculture，ynagling712100，China Correspondingauthor，chenhongl212@263．net DOI：10．3969~．issn．1674—7968．2011．06．010 Abstract Adipose—specificphospholipaseA2gene dPLA)isamajorregulatorofadipocytelipolysis，andin ordertoconstructtheprokaryoticexpressionsystem ofcattleAdPLA gene，thecodingsequenceofAdPLA gene wasobtainedbyOverlapPCRmethodfromcattle(Bostaurus)genomicDNAnadclonedintopGM—Tvector，the positiveclonesequencingresultwassameasthesequenceinGenBank (GenBankNo．NM_001075280)．The positiveplasmidwasdigestedwithBamH IandHindlll，thenthefragmentwasligatedwiththeexpressionvector pET28a(+)，therecombinedplasmidwastransformedintoEscherichiacoliBL21(DE3)andinducedwithIPTG． SDS—PAGE resultshowed thatthe fusion protein His-AdPLA wasexpressed in E．coli，which indicated the prokaryoticexpressionsystemofrecombinedvectorpET28a(+) dPLAwasconsturctedsuccessuflly．Thisstudy providesagoodfoundationforfurtherresearch ofcattleAdPLA geneand laysapathwayfordevelopinghte AdPLA proteinproducti