海洋活性物质分离纯化-液相色谱.pptx

一般流程及分离原理 检测器 反相色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 高效液相色谱的实验技术 高效液相色谱的应用 ;高效液相色谱法;一般流程及分离原理 一、简介 1.与经典的液相柱色谱法相比 (1)柱内径↓，填充剂粒度↓、均匀性↑，新型固定相的问世 → 分离效率↑。 (2)柱长↓，填充剂机械强度↑，供液压力和进样压力↑，流动相流速↑（1~5ml/min）→分离速度↑（7~8个峰/10min）。 (3)采用光学原理的检测器→灵敏度↑。 ; 2.与GC相比 (1)样品受限制少，对易分解、不容易气化、分子量大、高极性的有机物（70~80%的有机物）可用HPLC分析。 (2)不用制备衍生物，减少了误差。 (3)进样量大（500~800μL），易制备。 (4)分离效率降低。;二、一般分离流程;三、色谱原理;用液液分配色谱的机理来讨论高效液相色谱的普遍性问题。 ;四、色谱分离两大特点：差速迁移、谱带扩展;高效液相色谱检测器 目前应用较多的有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器、化学发光检测器、蒸发光散射检测器、安培检测器及示差折光检测器等。 1.紫外吸收检测器（ultraviolet detector , UVD） 紫外检测器是HPLC应用最普遍的检测器，利用紫外分光光度计的原理对各组分进行检测，属浓度型检测器。灵敏度、精密度及线性范围均较好。既用于等浓度，也用于梯度洗脱。但只能用于对紫外线有吸收的组分的检测，且流动相的选择有一定的局限性，其截止波长必须小于检测波长。; 2.荧光检测器（fluorophtometric detector, FD） 荧光检测器利用荧光分光光度计的原理对各组分进行检测，其灵敏度高于紫外吸收检测器，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。在用于氨基酸检测时，需用衍生法制备衍生物，其衍生法分为柱前与柱后衍生两种，常用邻苯二甲醛或异氰硫基苯为衍生化试剂，是分析氨基酸应用最广的方法。 ;3.示差折光检测器（RI） ; 4.蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector, ELSD） 蒸发光散射检测器是20世纪90年代出现的最新型通用检测器，可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外吸收的样品组分检测灵敏度较低，因而主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体类等几十类化合物。 ; 这种检测器是示差折光检测器的理想替代品。其检测原理是：将流出色谱柱的流动相及组分先引入已通气体的蒸发室，加热，使流动相蒸发而除去；样品组分在蒸发室内形成气溶胶，而后进入检测室；用强光或激光照射气溶胶产生光散射，测定散射光强而获得组分的浓度信号。; 5.化学发光检测器 化学发光检测器是近年来发展起来的高选择性及高灵敏度的新型检测器，其设备简单，自身发光，不需光源，价格便宜，是一种有发展前途的检测器，可用于药物代谢分析及免疫研究。其检测原理是：将流出色谱柱的组分与发光试剂混合，产生化学发光反应，光辐射可用光导纤维传输，由光电倍增管检测，从而获得信号。;几种主要检测器的基本特性 ;反相色谱（RPC）;一、固定相;①非极性键合相 此类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基键合相（十八烷基键合硅胶，octadecylsilane, ODS, C18）以及辛烷基（C8）、乙基、甲基和苯基键合相。其中苯基可诱导极化，所以也可视为弱极性键合相。 国内产品有YWG-C18和YWG-C8 和YWG-C6H5，国外代表性产品有：Nucleosil C18，Spherisorb ODS-2，Zorbox- C8等。HPLC中80%的分离工作所用的固定相都是ODS ，流动相为不同比例的水和甲醇，所以是反相技术。为提高固定相极性，可缩短烷基的链长度，选用YWG-C8为固定相。YWG-C6H5为反相，用于分离芳香族化合物。 ; ②中等极性键合相 常见的中等极性键合相有醚基键合相。这种键合相既可作正相又可作反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。国内产品有YWG-ROR′，进口产品有Permaphase-ETH。此类键合相应用较少。 ③极性键合相 常用的极性键合相有氨基、氰基键合相用。这种键合相既可作正相又可作反相色谱的固定相。国内产品有YWG-NH2、YWG-CN 和YQG-NH2、YQ