外源目的基因表达与调控.ppt

转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP负调节因子lacILac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶本底水平转录Lac表达系统正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPlacUV5突变体Lac表达系统转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始Lac表达系统负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶本底水平转录lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNATac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATlac、tac启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。lac、tac启动子对宿主菌的要求为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白