外源基因的原核表达（副本）.ppt

大肠杆菌表达系统的主要不足 1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程。 2、表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性 3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复杂。 常见的大肠杆菌表达系统 Lac和Tac表达系统：以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。通过对大肠杆菌tac I 基因诱变，获得能过量表达lac I 阻遏蛋白的基因突变体lac Iq，使外源基因的表达调控在一定的水平。此外，目前还构建了阻遏蛋白温度敏感型突变体lac Iq(ts)宿主菌和载体，使lac和tac启动子的转录受温度的控制，在低温(30oC)下基因的转录受到抑制，在(42oC)下基因的转录保持开放。 常见的大肠杆菌表达系统 PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞中含量的途径很难操作，因此在构建表达体系时，选用温度敏感突变体cl1857(ts)的基因产物调控PL和PR启动子的转录。 常见的大肠杆菌表达系统 T7表达体系：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的，具有很高表达能力的表达系统。T7噬菌体RNA聚合酶能选择性地激活T7噬菌体启动子的转录，这是一种活性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。在大肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体启动子控制的基因在T7噬菌体RNA聚合酶存在下进行高表达。 芽孢杆菌表达系统 芽孢杆菌中高效表达的策略 链霉菌表达系统 基因表达产物的检测与分离纯化 蓝藻表达系统 蓝藻是近年来迅速发展起来的一种很好的表达系统，蓝藻含有叶绿素和藻胆色素，具有光合系统，进行光合作用。蓝藻还具有原核生物的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体DNA裸露，是典型的原核生物。 蓝藻表达系统的特点 作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，表现为： 1、基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA检测； 2、细胞壁为革兰氏阴性，便于外源DNA的转化； 生物学因素的优化 溶氧量 pH值 温度 培养基成分 培养基的混合情况 四、高效表达目标基因的战略和技术 高密度发酵和工程化宿主细胞 大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。 目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种 构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。 虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从恨本上解决问题的途径之一。 芽孢杆菌是对人畜无害的革兰氏阳性土壤微生物。细菌细胞壁内不含内毒素，能分泌大量蛋白到胞外，目前已成为一些重要工业酶制剂的生产菌种。 1、多为非致病性微生物 2、培养条件简单，生长迅速 3、表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构象和生物学活性 4、遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作 5、培养发酵技术比较成熟 芽孢杆菌表达系统的不足 1、芽孢杆菌分泌的蛋白酶量大、种类多，对外源基因表达产物的稳定性形成很大威胁 2、载体不稳定，易造成外源基因的丢失 芽孢杆菌表达载体 复制子：目前广泛应用于芽孢杆菌表达载体的复制子有： 1、来源于金色葡萄球菌的复制子如pUB110、pC194和pE194等质粒表达载体。 2、来源于小芽孢杆菌的复制子如pHY481、pWT481等。 芽孢杆菌表达载体 启动子：在利用芽孢杆菌表达体系时，必需使用芽孢杆菌能够识别的启动子。芽孢杆菌含有多种转录起始识别因子(σ)，在芽孢杆菌中已鉴定的σ 已达十种。启动子可被特异的σ 因子识别。芽孢杆菌启动表达具有明显的时序性，与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。 表达载体： 1、自主复制质粒芽孢杆菌的自主复制质粒大多为无抗性标志的隐蔽质粒。带有抗性标志的自主复制质粒主要来自其它革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌如