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实验一 植物DNA的提取与测定
DNA的原理和方法,进一步了解DNA的性质。
二、原理
细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取DNA时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例:RNP在0.14 mol/L NaCl中溶解度很大,而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当NaCl浓度逐渐增大时,RNP的溶解度变化不大,而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的2倍,因此通常可用1.4 mol/L NaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品,可用适量的RNase处理提取液,以降解DNA中搀杂的RNA。
关于植物总DNA的提取主要有两种方法:
1. CTAB法:
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中。
2. SDS法:
利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸钠)使DNA与蛋白质分离,在高温(55~65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
一般生物体的基因组DNA为107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上,否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则:(1)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等)、多糖等杂质,并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子,故实现(1)尽量去除蛋白质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)。为实现(2)需要在DNA处于溶解状态时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行DNA溶液转移时用大口(或剪口)吸管。
提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物,一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”(melting temperature, Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1.实验材料
新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等
2.主要仪器
(1)高速冷冻离心机
(2)751型分光光度计
(3)恒温水浴
(3)液氮或冰浴设备
(4)磨口锥形瓶
3.试剂(CTAB法)
(1)CTAB提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0),20 mmol/L EDTA-Na2,1.4mol/L NaCl(如表1),2% CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的β-巯基乙醇。
表1 CTAB提取缓冲液配制
试剂名称 M.W. 配制1 000ml 配制500ml Tris 121.14 12.114 g 6.057 g EDTA-Na2 372.24 7.4448 g 3.7224 g NaCl 58.44 81.816 g 40.908 g 用HCl调
pH值。
(2)TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA( pH8.0)。
(3)DNase-free RNase A: 溶解RNase A于TE缓冲液中,浓度为10mg/ml,煮沸10~30min, 除去DNase活性,-20℃贮存(DNase为DNA酶,RNase为RNA酶)。
(4)氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V):240ml氯仿(A.R.)加10mL异戊醇(A.R.)混匀。
(5)3mol/L乙酸钠(NaAc,pH6.8):称取NaAc·3H2O 81.62g,用蒸馏水溶解,配制成200ml,用HAc调pH至6.5。
(6)无水乙醇
TE缓冲液,Tris-HCl(p
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