dna提取原理和方法.pptx

DNA extraction 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者为双链线性分子；后者为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。核酸的理化性质极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。提取DNA总的原则 :1 保证核酸一级结构的完整性；2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度；3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。DNA提取的几种方法断裂成为线状共价闭合环状结构　基因组DNA的提取　非基因组DNA的提取　质粒DNA的提取　基因组DNA的提取根据裂解方式的不同有：细胞破碎方法 应用 Ⅰ机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 Ⅱ物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 Ⅲ化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母　基因组DNA的提取高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。　硅质材料　 阴离子交换树脂 磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。根据核酸分离纯化方式的不同有：　吸附材料结合法：　基因组DNA的提取　浓盐法：　有机溶剂抽提法：　密度梯度离心法：　利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物基因组DNA－SDS法 SDS法流程图 （以动物组织为例） 离心洗涤抽提动物组织干燥溶解组织匀浆上层溶液酒精沉淀DNA溶液细胞裂解Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNAApproximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube;Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55oC overnight or until tissue is dissolved; More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT;Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; If there is no pellet, place samples in -80oC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4oC;Wash pellet once with 70% ethanol, air dry;Resuspend DNA in ddH2O.Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR. 2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55oC overnight or unti