DNA和RNA提取方法及原理.ppt

DNA和RNA提取方法及原理 DNA提取专题 前言 DNA提取原则 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－煮沸法 细胞器DNA－差速离心法 内容 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 基因组DNA的检测 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 RNA提取专题 分离提纯RNA的目的 分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物 RNA的不稳定性 由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活 提取RNA的注意事项 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染。 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 常用RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）： 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 。 异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 RNA提取专题 RNA提取的步骤 材料准备及裂解 杂质的抽提 RNA的沉淀和溶解 RNA的检测 电泳槽系统的处理 乙二醛化琼脂糖凝胶电泳 含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳 RNA纯度及浓度的检测 （A260=1 ，约40 μg/ mL RNA； A260/A280 约为1.9-2.1 ） RNA提取常见问题 RNA提取常见问题 RNA提取常见问题 问题三：DNA提取量少。 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 吸附或沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 原因 对 策 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。 增加吸附的时间，或低温沉淀 小心操作 第二部分：RNA提取及常见问题分析 第一部分：RNA提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析 第一部分：RNA提取方法简介 材料的裂解 杂质的去除 RNA的吸附或沉淀 异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使DNA及蛋白沉淀到有机相。 硅质材料的吸附 或用异丙醇沉淀浓缩RNA。 经DEPC 处理的水溶解RNA 尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。 组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。 对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的RNA样品储存液中保存。 液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。 RNA的提取 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中 对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提 RNA的提取 含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质 或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀，70％乙醇洗涤，晾干 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA 样品收集后或需长期保存时应置于－70℃ 或加入RNa