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硝化细菌分离与鉴定

硝化细菌-一类专性化能自养（无机营养）细菌，包括亚硝化菌和硝化细菌两个菌群，一

般种类不能生长在有机培养基中。在有氧的条件下，亚硝化细菌群将氨氮转化亚硝酸氮，硝

化细菌群将亚硝酸氮转化硝酸氮，两者常生长在一起。

硝化细菌分离比较困难，由于它生长缓慢，平均代时10-20h以上，且不同菌株间差异较大。

1.硝化细菌分离：

1.1分离材料：氨场周围的土壤池塘或污水出水口污泥

1.2培养基：

1.2.1富集培养基：

亚硝化细菌培养基：

1）硫酸铵5g/l磷酸二氢钾0.7g/l硫酸镁0.5g/l氯化钙0.5g/l用5％碳酸钠调PH8.0（硝

化细菌用亚硝酸钾2g/l代替硫酸铵5g/l）

2）硫酸铵2g/l氯化钠0.3g/l硫酸亚铁0.03g/l磷酸氢二钾1.0g/l硫酸镁0.03g/l碳酸氢钠

1.6g/lPH7.5-8.0

1.2.2分离培养基：

亚硝化细菌培养基：

甲液：硫酸铵11.0g硫酸镁1.4g硫酸亚铁0.3g蒸馏水100ml

乙液：磷酸二氢钾1.36g蒸馏水100ml

甲：乙=9:1PH8.0-8.2

硝化细菌培养基：

硫酸铵2.0g磷酸氢二钾1.0g/l硫酸镁0.5g/l氯化钠2.0g/l硫酸亚铁0.4g/l碳酸钙5.0g/l

PH7.5-8.0

用亚硝酸钾2.5g代替硫酸铵11.0g。为增加硝化细菌的分离效果，在培养液中添加1％粉状

碳酸钙和0.04ml/100ml微量元素溶液。

1.2.3BPY(肉膏蛋白胨酵母膏培养基)

牛肉膏5g/l酵母膏5g/l蛋白胨10g/l氯化钠5g/l葡萄糖5g/lPH7.0

（检查硝化细菌纯度用）

1.3富集培养：

取泥样1.0g或1.0ml活性污泥接入30ml/250ml三角瓶或10ml/18x180mm试管中，28-30℃

130r/min震荡培养，每隔几天用格利斯试剂在白瓷板上检验亚硝酸根的生成，培养7-8d后

培养液遇格利斯试剂呈红色，表明有亚硝酸盐存在。或检测硝酸根的存在，用二苯胺试剂

遇培养液呈蓝色，说明有硝化细菌存在，表明亚硝酸氮氧化成硝酸氮。用显色深浅判断作用

强弱，选出作用强的试管，吸两滴培养液接入新鲜培养液的试管（或1.0ml于30ml/250ml

三角瓶）中，继续培养并用同样方法测试，经几次反复操作不断淘汰其他异氧菌，在连续转

管时补加亚硝酸钠，增加培养硝化细菌的数量。

1.4分离培养：

1.4.1平板制作：

硅胶平板：

稀酸液制备：蒸馏水140ml，加浓硫酸（比重1.84）5ml，蒸馏水170ml，加浓盐酸（比重

1.19）20ml，两者混合均匀。

水玻璃制备：硅酸钠51.7g，加蒸馏水313ml溶解而成。

稀酸液：水玻璃=2:1混合，几分钟后，就形成乳白色的硅胶板，放入水槽用流水浸洗至氯

离子消除（用1％硝酸银检查浸洗水），用开水浸洗几次，无菌水洗几次，倒置稍干。

1

培养平板制备：每个平皿需加分离培养基2.0ml作为菌培养液和5％硫酸铵溶液1ml，轻轻

转动平板皿，使培养液分布均匀，打开皿盖，置于50-60℃温箱中，烘至表面无营养液流动

为止。

水洗洋菜平板：

市售洋菜在蒸馏水中浸泡2-3d，再用蒸馏水冲洗3-5次，直到洋菜呈白色透明，烘干待用。

以2％的水洗洋菜制备培养基，高压灭菌降至45-50℃后倒入培养皿，成水洗洋菜平板。

1.4.2分离培养：

分离前将富集培养液通二氧化碳或氮气30min，取0.1-0.2ml富集菌液滴入3-5个平板均匀涂

布或划线，28-30℃培养，水洗洋菜平板1-2周，硅胶平板2-3周，为防止水分蒸发，避免

平板干裂，倒置于盛有少量的水的干燥器中培养。当长出针状大小的菌落时，挑取10-15

个菌落，分别接种于富集培养液中，经液体培养检验，在继续重复涂布，反复几次得到单菌

株。

水洗洋菜