第九章 DNA序列分析.pdf

第9章DNA序列分析

oMaxam—Gilbert化学降解法

oSanger双脱氧链终止法

oDNA片段序列测定的策略※

o核苷酸序列的生物信息分析※

9.1Maxam—Gilbert化学降解法

9.1.1基本原理

o1977年，A．M．Maxam和W．Gilbert首先建立了DNA片段

序列的测定方法

o原理：将待测DNA片段的5端磷酸基团作放射性标记‘，

再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并

在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别

以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片

段群通过并列点样（lane-by-lane）的方式用凝胶电泳

进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基

序列。

o核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰

并在被修饰的碱基处（5′或3′）打断磷酸二酯键，从

而达到识别不同碱基种类的目的。

1

9.1.2化学降解测序法的基本步骤

o化学降解测序法的基本步骤包括：

（1）对待测DNA片段的5′端磷酸基团作放射性标记；

（2）用化学修饰剂修饰特定碱基；

（3）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度

（4）读序，由于在同一反应体系中，各DNA片段的标

记端相同、起始位点相同，所以，根据断裂部位至

标记端起始部位之间的距离（片段长度），即可得

出碱基顺序。

9.1.3化学修饰试剂

碱基体系化学修饰试剂化学反应断裂部位

G硫酸二甲酯甲基化G

A+G哌啶甲酸脱嘌呤G和A

C+T肼打开嘧啶环C和T

C肼+NaCl打开胞嘧啶环C

AC90℃，断裂反应A和C

NaOH(1.2mol/L）

哌啶（90℃，1mol/L）在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂

2

图9-1Maxam-

Gilbert化学降

解法测序原理

3

9.2Sanger双脱氧链终止法

9.2.1基本原理

p1977年英国的F．Sanger设计的方法

o双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3位置的‘-

OH缺失，致使下位核苷酸的5磷酸基团‘无

法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正

在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此

终止。

图9-2双脱氧

核苷酸

（ddNTP）分

子结构及DNA

链合成终止反

应

oA．正常

的DNA合

成反应；

oB．ddNTP

掺入到

DNA合成

反应后导

致反应终

止

4