克氏原螯虾血蓝蛋白的分离纯化及抗凡纳滨对虾免疫印迹试验.docx

克氏原螯虾血蓝蛋白的分离纯化及抗凡纳滨对虾免疫印迹试验 食物过敏是一种常见的致病性突变，近年来发病率显著增加。 食物过敏已成为食品安全隐患之一, 是当下亟待解决的问题 近年来, Piboonpocanun等人从罗氏沼虾血淋巴中纯化得到分子质量为60~80 ku的蛋白, 经LC-MS/MS鉴定为血蓝蛋白亚基, 且能与过敏患者血清发生明显的免疫交叉反应 血蓝蛋白是否也为克氏原螯虾的过敏原, 国内外尚未见报道。 本研究以克氏原螯虾为试验材料, 分离纯化血蓝蛋白, 比较血蓝蛋白与甲壳类主要过敏原原肌球蛋白的性质, 明确克氏原螯虾血蓝蛋白的过敏原性, 为保障水产食品的安全性奠定基础。 1 材料和方法 1.1 免疫印迹用血蓝蛋白的免疫法 克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 购自厦门市第8 菜市场。 现杀取血淋巴。 Sephacryl S-200 HR和硝酸纤维素膜, 瑞典Amersham Biosciences公司;SDS所用的标准蛋白, 立陶宛Fermentas公司; 免疫印迹所用的预染标准蛋白, 美国New England Biolabs公司; 羊抗人Ig E-HRP, 美国Kirkegaard Perry Laboratories公司; 羊抗兔Ig G-HRP和化学发光试剂, 美国Pierce公司;可溶性单组分TMB底物溶液, 中国TIANGEN公司;猪胰液 (含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶) , 美国Sigma公司。 猪胃蛋白酶、纯化的原肌球蛋白由本实验室工作人员制备。 兔抗凡纳滨对虾血蓝蛋白多克隆抗体由汕头大学章跃陵教授提供。 其他试剂均为分析纯试剂。 45 份甲壳类过敏患者血清和2 份健康人血清由集美大学医疗中心提供。 45 份过敏者均有典型的过敏病史, 症状包括荨麻疹、哮喘、过敏性鼻炎等。 2 份健康人血清混合作为阴性血清池。 1.2 酶联免疫吸附试验elisa ELISA检测过敏血清参照刘光明等 1.3 血液中蓝色蛋白质的纯度 参考章跃陵等 1.4 免疫分析 免疫印迹依照Towbin等 1.5 缓冲液ph的影响 1.5.1 糖含量测定糖蛋白中的糖含量测定采用苯酚-硫酸法 1.5.2 热稳定性分析将纯化的血蓝蛋白和原肌球蛋白分别于30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (℃) 下孵育30 min后, 进行SDS分析及考马斯亮蓝染色。 1.5.3 p H稳定性分析室温下, 将血蓝蛋白和原肌球蛋白分别于不同p H缓冲液 (p H 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.0, 9.0, 11.0) 中放置1.5 h, 然后进行SDS分析。 1.5.4 消化稳定性分析体外模拟胃液 (simulat-ed gastric fluid, SGF) 消化参照Huang等 体外模拟肠液 (simulated intestinal fluid , SIF) 消化反应中, 在1 m L模拟肠液反应体系中, 胰液 (含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶) 与纯化血蓝蛋白、 原肌球蛋白的比例分别为1∶50, 1∶250 (m/m) 。该反应在37 ℃水浴条件下振荡进行, 分别于反应时间为0, 1, 15, 30, 60, 120, 180, 240 min时取出100 μL反应液, 于95 ℃下加热5 min终止反应。其中, 0 min样品是将含有蛋白酶的SIF先加热失活, 然后加入一定量的底物。 以不加胰液为对照组, 反应240 min, 其余步骤相同。 2 结果与分析 2.1 elisa分析 分别以克氏原螯虾的肌原纤维、肌浆蛋白、血淋巴为抗原, 采用45 份甲壳类过敏患者血清进行ELISA分析。 结果显示 (表1) , 分别有19 份和15份血清与肌原纤维、 肌浆蛋白发生了特异的Ig E结合反应, 6 份血清 (编号094, 099, 036, 049, 038, 024) 与血淋巴发生了特异的Ig E结合反应。 2.2 凝胶柱层析分离的目的蛋白 将用克氏原螯虾抽取的血淋巴离心, 取上清。SDS分析结果如图1a所示, 克氏原螯虾血淋巴蛋白分子质量主要集中在60 ku以上。 通过Sephacryl S-200 HR凝胶柱层析得到纯化的目的蛋白, 这些目的蛋白由68, 72, 76, 82, 84, 88 ku 6个亚基组成 (图1b) 。 为了确认所纯化的蛋白是否为血蓝蛋白, 以兔抗凡纳滨对虾血蓝蛋白多克隆抗体作为一抗 (1∶8 000) 进行免疫印迹检测。 如图1c所示, 目的蛋白6 个亚基均与兔抗凡纳滨对虾血蓝蛋白多克隆抗体发生明显的免疫交叉反应, 证实纯化蛋白确为血蓝蛋白。 2.3 抗整体抗重点难度 以纯化的克氏原螯虾血蓝蛋白为抗原, 6 份甲壳类过敏患者血清 (编号094, 099, 036,