血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用.ppt

血清白蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定 目的要求 (一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。  (二)了解柱层析技术。 （一）分离纯化的意义 ①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。 ②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。 ③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 ④基因工程的需要 （二）分离纯化的要求 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 （三）分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： ①材料的选择和预处理 ②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） ③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。 常用的蛋白质分离纯化技术 一、盐析（中性盐沉淀） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法的优点： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 盐析的基本原理 蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 破坏水化膜，暴露出疏水区域， 中和电荷，破坏亲水溶胶 Salting-in 蛋白质聚集沉淀 中性盐的选择 常用的中性盐：(NH4)2SO4 1) 溶解度大： 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有 的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。 分段盐析 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。 二、脱盐（凝胶层析法） 阳离子交换剂（cation exchanger） 球蛋白中： α及β球蛋白的pI＜6.5，带负电 而γ球蛋白的pI＞6.5(pI7.3) ，带正电 γ球蛋白先洗脱出来。 白蛋白中： α、β及白蛋白均带负电，挂于柱上 先用低盐洗去α、β球蛋白 再用高盐竞争洗下白蛋白 操 作 一、盐析 －－ 白蛋白、γ球蛋白的粗分离 1 取0.5ml血清 2 取0.5ml饱和(NH４)２SO４溶液， 缓慢滴入，边加边摇。 3 混匀后于室温中放置10分钟。 4 8000r/min×10min 5 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。 6 沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化 γ球蛋白用。 洗脱液中蛋白质及盐分的检查 取96孔板一块，上四排加300g/L三氯乙酸溶液 ，下三排加BaCl2液。 从下端管口取1滴洗脱液，滴于300g/L三氯乙酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。 从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。 二、G-25凝胶层析脱盐 （一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备 3、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量pH6.5的0.02mol/L NH4Ac缓冲液。 4、放开，流速约20滴/分钟，立即收集并检测， 20％磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，10滴/管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。 5、 BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。 6、平衡再生：继续洗脱30ml。 7、白蛋白样品脱盐。 15滴/管收集 三、纯化（阴离子交换层析） 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗脱， 分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，10滴/管，编号。（纯化的γ-球蛋白） 继续洗脱30ml 将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/L NH4Ac洗脱30ml。 改用0.3mol/L NH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/