荧光定量PCR的原理及临床应用2(学生讲课HCMV)幻灯片.ppt

荧光定量PCR的原理及临床应用 如何做一个“聪明”的实习生 实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。 如何做到： ①实习之前要复习理论知识和实验课内容 “理论先行” ②实习过程中要“聪明” ③做好实习笔记，用心思考，实习之外下功夫 如何做一个“聪明”的实习生 聪 明 内容概要 PCR的定义和原理 荧光定量PCR的原理和分类 荧光定量PCR结果的分析 荧光定量PCR在临床的应用 PCR的定义 PCR是Polymerase Chain Reaction的缩写，中文称为聚合酶链式反应，由变性、退火及延伸几步反应组成一个周期,循环进行,可使目的DNA得以迅速扩增。 由美国PE公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCR技术的跨时代意义，Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。 PCR的原理 变性：双链DNA在高温下解开成单链的过程 。温度一般为95℃左右。 PCR的原理 退火：温度下降后，两条配对的单链DNA重新结合为双链的过程。温度一般为50~60℃。 PCR的原理 延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应 。温度一般为72℃左右。 普通PCR的原理 普通PCR的原理 PCR反应成分： 1.模板DNA 2.引物 3.四种脱氧核糖核苷酸 4.DNA聚合酶(Taq酶) 5.反应缓冲液、Mg2+等 6.荧光探针（荧光定量PCR） Taq酶的发现 在Taq酶发现之前，实验室的PCR反应中运用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ι的Klenow片段。 Klenow酶不耐高温，90℃加热后会变性失活，每次循环结束都要加入新鲜的酶。 而且DNA的延伸是在37℃完成，模板和引物容易错配，造成反应的特异性很差。 Taq酶的发现 美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌(Thermus aquaticus)株，Cetus公司研究人员从中分离了Taq DNA聚合酶 特点：①耐高温：70℃ 2h 活性90%，93℃ 2h 活性60%，95℃ 2h 活性40% ； ②延伸温度较高(一般为72 ℃)：大大提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率。 荧光定量PCR 概念：在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号累积或变化实时监测整个反应过程，最后通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems，ABI公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。 实时荧光定量PCR的原理 利用荧光信号的变化实时监测PCR反应的每个循环的扩增产物量的变化。 通过Ct值和标准曲线分析对起始标本的模板量进行定量分析。 与普通PCR的比较 普通PCR完成后，一般只对扩增的最终产物量进行分析，分析结果多为定性或者半定量结果。 荧光定量PCR通过监测荧光值的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为定量结果。 与普通PCR的比较 普通PCR完成后，才能进行扩增产物的分析，而且分析的过程可能产生一定的生物危害和环境污染。 荧光定量PCR的扩增和产物分析过程是同时完成的，而且在封闭的反应体系中进行，比较安全，易于处理。 常用的名词概念 本底信号（Baseline） 荧光阈值（Threshold） Ct值（Ct value） 扩增曲线 常用的名词概念 实际中的运用 实时荧光定量PCR的分类 目前的实时荧光定量PCR均是基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理。 荧光共振能量转移（FRET）发生的条件 荧光基团和淬灭基团都能发射荧光 荧光基团的发射光谱和淬灭基团的激发光谱需有效重叠 荧光基团和淬灭基团应足够的近（10nm） 常见的实时荧光定量PCR TaqMan探针法实时荧光定量PCR 分子信标探针法实时荧光定量PCR 双链DNA交联荧光染料法实时荧光定量PCR 双杂交探针法实时荧光定量PCR 蝎形探针法实时荧光定量PCR 探针的荧光标记 探针在其5’端标记一个荧光基团，如6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)等 探针在其3’端标记一个淬灭基团，如6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA) TaqMan探针法实时荧光定量PCR 分子信标探针法实时荧光定量PCR 荧光染料法实时荧光定量PCR 几种方法的比较 荧光定量PCR在临床的应用 在实际的临床应用中，TaqMan法的荧光定量PCR比较多见。 TaqMan法特异性高，重复性好，价格适中，可以满足临床上检测特定项目的要求。 荧光定量PCR在临床的应用 常见的异常结果：