实时荧光定量PCR介绍幻灯片.ppt

3 Real Time PCR解析方法 1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法 Real Time PCR解析方法 绝对定量解析方法 提取样品 引物设计 标准品制备 Real Time PCR反应 数据分析 流 程 绝对定量解析方法 通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。 105 104 103 101 扩增曲线图 标准曲线图 检测样品 检测样品 102 相对定量解析方法 以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 进行相对表达量分析必要性 实际上目的基因表达量分析 相对定量解析方法 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 主 要 内 容 Real Time PCR基础知识 1 2 Real Time PCR实验方法 3 Real Time PCR解析方法 4 Real Time PCR应用实例 ◇ 对SARS病毒基因进行定量分析 绝对定量 相对定量 ◇ 分析小鼠PAH基因在不同组织中的表达量变化 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量 检测方法 TaqMan? probe 法 检测样品 3个从SARS样品中提取的Total RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript? RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（DRR064） 仪 器 Smart Cycler Ⅱ SYN247 F02 SYN247R03 SYN247 F01 SYN247R02 SYN247R01 SYN247 F01 BamH Ⅰ Hind Ⅲ pBluescript II SK(+) Vector T7 Promoter BamH Ⅰ Hind Ⅲ Sac Ⅰ site SARS Control RNA构建 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 纯化的SARS Control RNA OD值测定结果 体外转录的SARS Control RNA 电泳照片 M1 M2 M1: ?-Hind Ⅲ digest M2: DL2,000 Marker DNase I 处理前 DNase I 处理后 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量 ?DNA BNITMSARAs2 Adaptor R SacⅠsite Bam HⅠsite BNITMSARS1 Adaptor F T7 Promoter SARS Internal Control RNA的构建 A A pBluescriptII SK(+) Vector 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量 探针的选择 Template Primer TaqMan? Probe 5’ 端报告基团 3’ 端淬灭基团 SARS Control RNA or SARS Genomic RNA 共用 FAM标记 Eclipse标记 SARS Internal Control RNA 共用 ROX标记 Eclipse标记 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量 SARS Control RNA 105-101扩增曲线 SARS Genomic RNA Sample 1、２、３扩增曲线 SARS Internal Control RNA扩增曲线 标准曲线 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量 定量结果 对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量 相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况 检测方法 SYBR Green I 荧光嵌合法 管家基因 GAPDH基因 目的基因 PAH基因 标 准 品 cDNA 试 剂 PrimeScri