荧光定量PCR的原理及其应用.ppt

荧光定量PCR原理相对定量无需制备标准品(2-ΔΔc(t)法)，需要内参照基因，注意扩增效率(内参与目的基因扩增效率相近）差异表达分析，芯片结果验证等插入染料法SYBRGreenI杂交探针法TaqMan荧光定量PCR原理插入染料方法的原理5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’SYBRGreenITaqIDl延伸5’3’5’3’5’3’5’3’检测激发的荧光5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’退火IDIDIDIDIDIDIDIDIDIDlllll插入染料法相对成本低对引物的设计要求较高（注意非特异性扩增）不需要设计探针，通用性强不能做多重PCRMeltingCurveanalysis逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光强度TmTm值：一半DNA解链时的温度-dIdTTmSolvethenon-specificproductMeltingcurve优化条件更换引物权宜之计95℃10sec60℃15sec72℃30sec80℃10secdetection40cyclesTaqMan探针分子信标探针（MolecularBeacons）荧光定量PCR原理杂交探针方法TaqMan探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应体系变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ5’3’5’3’5’3’RQ退火5’3’1.链取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.检测荧光5’3’3’QTaqR5’l可以做多重检测扩增特异性强成本较高MolecularBeacon发夹结构退火时与靶片段结合引物延伸时被切断More…荧光定量PCR应用医疗领域的应用1科学研究方面的应用2公安系统内的应用3动植物检疫4考古学方面的应用5……6医疗方面的部分应用（1）：临床检测：疾病的临床早期诊断如各种肝炎、性病、遗传性疾病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等疗效考评指导制订感染性疾病合理治疗方案了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况医院、血站及防疫站的确诊荧光定量PCR应用医疗方面的部分应用（2）：遗传病诊断：等位基因检测多基因遗传病的突变检测基因表达异常所致遗传病检测荧光定量PCR应用医疗方面的部分应用（3）：肿瘤诊断：肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因肿瘤标志物如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等肿瘤耐药基因（MDR）荧光定量PCR应用研究方面的部分应用（1）：分子生物学方面：研究各种处理对细胞mRNA含量变化的影响比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究荧光定量PCR应用研究方面的部分应用（2）：植物学方面：转基因植物中基因拷贝数与性状的关系监测转基因植物中基因拷贝数的变化转基因植株早期的筛选监测农作物病虫害抗药性变化荧光定量PCR应用研究方面的部分应用（3）：动物学方面：动物疫情监测新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究转基因动物中目的基因拷贝数与品质