普通免疫学单克隆抗体 (2).ppt

第93页,共109页，星期六，2024年，5月第94页,共109页，星期六，2024年，5月第95页,共109页，星期六，2024年，5月第96页,共109页，星期六，2024年，5月第97页,共109页，星期六，2024年，5月STEP6:检测方法第98页,共109页，星期六，2024年，5月第99页,共109页，星期六，2024年，5月样品1样品2第100页,共109页，星期六，2024年，5月第101页,共109页，星期六，2024年，5月第102页,共109页，星期六，2024年，5月电泳迁移率：在特定介质中单位电场强度的带电颗粒电泳移动速度。电泳迁移率与颗粒所带电荷量成正比，与颗粒的半径和介质黏度成反比。实际工作中常用相对电泳迁移率，即两种带电颗粒在同一介质、同一电场中泳动距离之比。一般情况下电泳中蛋白质分子量对数与迁移率呈线性关系。第103页,共109页，星期六，2024年，5月免疫学的应用第104页,共109页，星期六，2024年，5月1.免疫监测第105页,共109页，星期六，2024年，5月人绒毛膜促性腺激素（HCG）的免疫监测尿液胶乳胎盘合体滋养层细胞产生大量的人绒毛膜促性腺激素，可通过孕妇血液循环而排泄到尿中第106页,共109页，星期六，2024年，5月人绒毛膜促性腺激素的免疫监测-阴性对照第107页,共109页，星期六，2024年，5月2.免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分离蛋白第108页,共109页，星期六，2024年，5月Co-IP工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYY第109页,共109页，星期六，2024年，5月第61页,共109页，星期六，2024年，5月如何得到亲和力高、特异性强的抗体克隆？通过遗传工程技术改造与生产抗体第62页,共109页，星期六，2024年，5月抗体基因文库将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体（噬菌体）中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库。从这个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。优点：一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得亲和力高、特异性强的克隆抗体。第63页,共109页，星期六，2024年，5月主要的抗原抗体反应第64页,共109页，星期六，2024年，5月第65页,共109页，星期六，2024年，5月抗体效价的测定血清：血液凝固析出的淡黄色透明液体，在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原。抗体效价(滴度，titer)：通过血清学方法能显示一定反应的抗血清(或抗体)的最高稀释倍数(或稀释度的倒数)。如终点稀释度为1/100，则血清的效价(每1ml的血清中抗体效价)为100抗体单位的高低是衡量血清中抗体水平的一项检测指标。第66页,共109页，星期六，2024年，5月试管凝集实验（tubeagglutinationtest）原理：大分子颗粒性抗原（细菌、红细胞）与其相应的抗体相结合，在适量的电解质存在及一定的温度下，经过一定的时间可出现肉眼可见的凝聚团块。一般以标准抗原测得免疫血清或患者血清中抗体的效价。第67页,共109页，星期六，2024年，5月不加免疫血清＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋：凝聚强度＋：出现凝聚－：无凝聚第68页,共109页，星期六，2024年，5月抗体稀释度应根据：①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,减少或消除其中交叉抗体反应。第69页,共109页，星期六，2024年，5月三、常见免疫分析方法利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点。免疫沉淀1.环状沉淀实验：是溶液中的沉淀反应。在体外当抗体与相应抗原二者浓度比例恰当时，会发生免疫沉淀。第70页,共109页，星期六，2024年，5月抗体与多价抗原结合的浓度带现象第71页,共109页，星期六，2024年，5月2.免疫双扩散抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。双扩散是在琼脂板中抗原和抗体分别从相