第三章 层析技术(B).ppt

* * * * * * * * 說明文字 * * * * See you next chapter * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2、层析基质的选择 （1）一般应具备以下几个条件： A、不溶于水，且高度亲水，易与水中的生物大分子结合； B、通透性好，具多孔的立体网状结构，利于大分子的流动和渗透； C、具有较好的理化性质，在较宽的pH、离子强度和变性剂浓度范围内能稳定工作； D、具有良好的机械性能，最好具有一定的颗粒形式，保持一定的流速，进而促使扩散速率低的生物大分子很快达到扩散平衡； E、具有较多的化学基团可供活化，以结合较多的配体； F、化学性质为惰性，以降低非特异性的吸附； G、有能抵抗微生物和酶的作用，且不被生物物质损坏，便于亲和固定相的使用和保存。 层析基质 pH范围 交联琼脂糖 纤维素 葡聚糖 硅胶 玻璃 聚丙烯酰胺 羟乙基异丁烯酸 环氧乙烷-丙烯酸聚合物 苯乙烯-二乙烯苯聚合物 聚丙烯醇 N-丙烯酰基-2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇 聚四氟乙烯 2-14 1-14 2-14 8 8 3-10 2-12 0-12 1-13 1-14 1-11 不受pH影响 （2）层析基质的活化 配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。 指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 1）多糖基质的活化 A、溴化氰法 是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（-NH2）反应，主要生成异脲衍生物。 20ml、2mol/L碳酸氢钠+20g湿琼脂糖，冰浴4-5min 搅拌过程中加入溴化氰，4-5℃10min 过滤，冷蒸馏水和缓冲液洗涤 加入溶于缓冲液中的配基，搅拌2h，4℃保存 活化耦联过程 这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。 另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。 B、环氧基活化法 在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物。 活化后的基质都含有环氧乙基，可以结合含有伯氨基（-NH2）、羟基（-OH）和硫醇基（-SH）等基团的配体。 这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N-C、O-C 和S-C 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。 它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。 2）聚丙烯酰胺的活化 聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。 一般有以下三种方式：氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。 聚丙烯酰胺的活化 3）多孔玻璃珠的活化 通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺-玻璃，在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。 （3）间隔臂分子 在亲和层析中，由于配体结合在基质上，它在与待分离的生物大分子结合时，很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。 尤其是当配体较小或待分离的生物大分子较大时，由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质，而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体，影响了待分离的生物大分子与配体的结合，造成吸附量的降低。 解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架相外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。 加入手臂的长度要合适，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附率。 （4）配体和基质的偶联 通过化学反应使配体和基质共价结合，制成亲和吸附剂。 注意事项： 偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联的配体； 用适当的方法封闭没有偶联上配