第三讲 层析技术.ppt

第三讲 层析技术 主要内容 一、层析分离的基本概念 二、层析分离的分类 三、层析分离的基本原理 四、层析过程和仪器设备 五、具体应用 一、层析分离的基本概念及其特点 层析分离技术早在二十世纪初就已在生产实践中使用。 1903年，俄国植物学家茨维特(Tswett)在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，用石油醚作为洗脱剂，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内形成了数条相互分离的色带，当时茨维特把这种色带叫作“色谱”（Chromatographie）。 在这一方法中把玻璃管称为“色谱柱”，碳酸钙称为“固定相”，纯净的石油醚称为“流动相” 。因此，层析分离又称色谱分离（Chromatographic Resolution, CR）或色层分离，本讲统一使用层析分离这一名称。 一、层析分离的基本概念及其特点 层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸……）以不同的速率移动，从而达到分离的目的。 二、层析分离的分类 1.按分离机理不同分类 吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析 2.按固定相形状不同分类 柱层析层析、纸层析层析、薄层层析层析 3. 根据流动相的物理形态不同分类 气相层析、液相层析、超临界流体层析 4. 根据操作压力不同分类 低压层析分离（0.5MPa） 中压层析分离（0.5~5MPa） 高压层析分离（5~50MPa） 三、层析分离的基本原理 （一） 吸附层析 （二）分配层析 （三）凝胶过滤层析 三、层析分离的基本原理 （一）吸附层析 原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。 吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙等。 特点：应用最早，价格较低；选择性低。 新型吸附层析技术：离子交换层析、亲和层析、金属鳌合层析、疏水作用层析等。 离子交换层析 利用离子交换剂作为层析支持物（固定相），由于带有不同电荷的蛋白质与固定相间的静电作用力（吸附力）不同，从而达到分离目。 离子交换层析 离子交换剂主要由三部分组成——载体、官能团及可交换离子。 亲和层析 基本原理：利用了生物物质间的特异性相互作用，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的一种层析分离技术。 亲和层析 琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶等。 介质商品种类： Sepharose 2B（2%） Sepharose 4B（4%）、 Sepharose 6B（6%） 经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B、 Sepharose CL-6B 亲和层析 ①酶-底物类似物，抑制剂，辅因子； 谷胱甘肽-谷胱甘肽-S-转移酶（GST），GST融合蛋白 ②抗体-抗原——免疫亲和层析 ③凝集素-多糖，糖蛋白，细胞表面因子受体； ④核酸-互补碱基序列，核酸多聚酶，核酸结合蛋白； ⑤三嗪类色素-脱氢酶、激酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶等——色素亲和层析 ⑦肝素-脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白等 ⑧过渡金属离子：可与N, S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发生亲和结合作用——金属螯合层析 亲和层析 当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。需要在配基与载体连接一个“接枝手臂”，以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效的亲和结合。 金属螯合层析 层析介质中连接有可螯合基团，如：亚氨基二乙酸（ NH2CH2(COOH)2 ，IDA），与某些金属离子络合后，可以吸附某些蛋白质（金属螯合介质能与蛋白质中的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合） 。 不同蛋白分子形成的配位键的强度各异，从而起到分离纯化作用。 金属螯合层析 Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC) was first used to purify proteins in1975 (Porath et al. 1975) using the chelating ligand iminodiacetic acid (IDA, Figure 4). IDA was charged with metal i