免疫印迹-讲解.ppt

操作步骤 lSDS待胶凝固后开始点样(上样量5ul)，70V积层胶；170V分离胶 l 转膜 1.PVDF膜的准备处理；大小应与凝胶吻合，不要大于凝胶。依次将PVDF膜放在甲醇中10秒，去离子水中5分钟，电转移液10分钟。 2.纤维垫的准备； 应将纤维垫放在电转移液中使其完全浸透。 3.滤纸的准备；将与凝胶大小的滤纸泡入电转移液中10分钟。 操作步骤 4.安装：打开转移盒后分别将 （1）纤维垫铺在黑色多孔板上 （2）将与凝胶大小的滤纸轻轻放在纤维垫上 （3）小心将凝胶放置在滤纸上，用玻璃棒赶跑气泡 （4）将PVDF膜放置在凝胶上，用玻璃棒赶跑气泡 （5）将滤纸轻铺于PVDF膜上，用玻璃棒赶跑气泡 （6）纤维垫铺好，盖好白色多孔板上。 5.将转移池中注满电转液，恒压100V转移1小时，或者30V过夜. 操作步骤 检测 1.封闭：将膜小心取出后用蒸馏水冲洗，放入封闭液（3%的BSA）中封闭1小时，同时将胶染色 2.洗涤：用洗涤液洗涤3—5次，每次10分钟。 3.结合一抗：用1%的BSA封闭液10000倍稀释一抗，37度孵育1小时 4.洗涤：同上洗涤3—5次，每次10分钟 5.结合二抗：用1% 的BSA稀释二抗10000倍，37度孵育1小时 6.洗涤： 同上用洗涤液洗3—5次，每次10分钟 7.显色：用Amersham的ECL显色底物，分别取1ml 2ml溶液混合，涂于膜上 8.成相：（1）将膜放在暗盒中，上铺保鲜膜。 （2）在暗室中剪合适大小的X光片，放在另一暗盒中 （3）取X光片迅速放在膜上，盖好暗盒，开始记时，5秒后取出胶片 （4）放在显色液中3分钟，不断用镊子拨动， （5）放入定影液中2分钟后，取出胶片用清水冲洗即可观察 操作步骤 检测 1.封闭：将膜小心取出后用蒸馏水冲洗，放入封闭液（3%的BSA）中封闭1小时，同时将胶染色 2.洗涤：用洗涤液洗涤3—5次，每次10分钟。 3.结合一抗：用1%的BSA封闭液10000倍稀释一抗，37度孵育1小时 4.洗涤：同上洗涤3—5次，每次10分 5.结合二抗：用1% 的BSA稀释二抗10000倍，37度孵育1小时 6.洗涤： 同上用洗涤液洗3—5次，每次10分钟 操作步骤 检测 1.封闭：将膜小心取出后用蒸馏水冲洗，放入封闭液（3%的BSA）中封闭1小时，同时将胶染色 2.洗涤：用洗涤液洗涤3—5次，每次10分钟。 3.结合一抗：用1%的BSA封闭液10000倍稀释一抗，37度孵育1小时 4.洗涤：同上洗涤3—5次，每次10分 5.结合二抗：用1% 的BSA稀释二抗10000倍，37度孵育1小时 6.洗涤： 同上用洗涤液洗3—5次，每次10分钟 操作步骤 自显影 1.将膜放在暗盒中，上铺保鲜膜。 2.在暗室中剪合适大小的X光片，放在另一暗盒中。 3.取X光片迅速放在膜上，盖好暗盒，开始记时，5秒后取出胶片。 4.放在显色液中3分钟，不断用镊子拨动。 5.放入定影液中2分钟后，取出胶片用清水冲洗即可观察。 * * 免疫印迹 Western Blotting Western Blotting 免疫印迹 主要内容：一、印迹的概念和分类二、印迹的流程三、免疫印迹过程四、免疫印迹技术的应用 一、印迹的概念与分类 印迹(Blotting)的概念 Southern Blotting Northern Blotting Western Blotting Eastern Blotting Dot Blotting Southern Blotting Southern Blotting Flow Chart of Southern Blotting Preparing the samples and running the gel Southern transfer Probe preparation Prehybridization Hybridization Post-hybridization washing Signal detection Isotope Non-isotope The flow Chart of Northern Blotting Prepare RNA samples and run RNA gel Northern transfer Probe preparation Prehybridization Hybridization Post-hybridization