免疫印迹法的实验技术.ppt

根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大小及时间.我们通常200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间(h)801408%1.5-2.0258010%1.515—4012%0.752015%0.5NC膜预处理：（剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上。注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，避免手上蛋白将膜污染。）剪裁6层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同时4层海绵垫也用转移液浸泡。取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转移液中。12345制作“三明治”：由夹子的黑板（阴极）侧开始，依次为黑板→海绵垫片→3层滤纸→胶→NC膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片(阳极)，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。转膜实验步骤1正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作宜在4℃进行）。2小心取出转移膜，做好标记，在1×TBST液中漂洗两次。3（用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全,用丽春红染色液膜,检测蛋白质是否转移到膜上.）打开转膜夹板，由阴极侧海绵垫片→3层滤纸→样品凝胶→NC膜→三层滤纸（排除气泡）→海绵垫片阳极侧实验注意事项PVDF膜需100%甲醇预处理，再用缓冲液平衡，才能用。必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中,滤纸要充分浸于转移缓冲液中.操作要轻，避免胶膜的破损。记住“黑面胶，白面膜”，夹子的黑面朝架子的黑面。必须保证“三明治”各层之间均无气泡。电转移时最好为恒流,电转移的时间和电流大小取决于凝胶的厚度和蛋白质分子量的大小.分子量大,电流稍大时间长;分子量大,电流小时间短;注意做好膜上的标记。LOGOLOGO免疫印迹法的实验技术

（WesternBlot印迹方法）WesternBlot，又称为免疫印迹（Immunoblot）,是70年代末80年代初发展起来的蛋白质测定技术。蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化学》（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。一、Western-Blot简介印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。WesternBlot印迹方法，是检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。实验主要内容：实验用途2实验注意事项4实验方法及步骤33实验原理31实验原理将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶【SDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离→凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物（硝酸纤维素膜或PVDF膜）上→用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合→用ECL发光或DAB显色检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄色条带蛋白条带。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。01用于检测样品中特异性蛋白质是否存在。02对特异性蛋白质进行半定量分析。实验用途凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带样品的印迹把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上免疫学检测用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原蛋白免疫印迹组成实验步骤提取细胞或组织蛋白→测定蛋白含量→制