免疫印迹实验报告westerblot.doc

PAGE  PAGE 4 Western blot实验报告 摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法：western blot 结果：见后文 结论：western blot能很好地分离蛋白 关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白 Western blot test report Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sdsand electric transfer Results: see below Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 1 试剂与仪器 1.1 试剂（所有试剂均供两组用） 1.1.1 8%电泳分离胶的配制 H2O 6.9ml 30%丙烯酰胺 4.0ml 1.5mol/L Tris 3.8 ml 10%SDS 0.15 ml 10%过硫酸胺溶液 0.15 ml TEMED 0.015 ml 1.1.2 5%浓缩胶配制 H2O 5.5ml 30%丙烯酰胺 1.3ml 1.0mol/L Tris 1.0 ml 10%SDS 0.08 ml 10%过硫酸胺溶液 1.08 ml TEMED 0.015 ml 1.2 仪器 夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸 2 试验步骤 2.1 蛋白质的提取 2.1.1取小鼠组织0.2g，用生理盐水洗去表面毛发等杂物，剪碎，加入生理盐水2ml； 2.1.2 移入匀浆器，匀碎 2.1.3 用移液枪移取1ml匀浆液入1号EP管中； 2.1.4 离心12000转，10min 2.1.5 取1号EP管中层清液入2号EP管 2.1 SDS电泳分离 2.1.1 2片玻璃片以清水洗净，再以卫生纸擦干，欲做胶的那一面以酒精洗净，再以拭镜纸擦干净，最後將2片玻璃片贴好。將2片玻璃片放入造胶台中，注意2片玻璃片的底部需相当平整，再將水加滿，观察5分钟后水外漏的比率，若外漏速率太快，则拆掉重新摆放。倒掉2片玻璃片间的水，用滤纸將水吸除，尽量完全吸干，避免胶体浓度不足 2.1.2 使用塑胶滴管將配好的溶液加入製胶台中，約加到绿色橫桿下缘，尽量不要太多，否則齿梳會直接刺到下层胶(上胶预留2cm空間) ，在上面铺一层水，与空气隔绝，加速凝固。 2.1.3倒掉H2O，用滤纸將水吸干，但不要碰到胶，用塑胶滴管吸取上胶的溶液，滴入至玻璃片全滿的位置，將齿梳插入，含有acrylamide之溶液有毒，避免接触到身体，此時液体可能会喷出 2.1.4等待20分钟，可以观察烧杯留下一些剩余液体，可以判断凝固程度，如果烧杯中的残留液体凝固，则代表胶体已经凝固，拆除齿梳。 2.1.5紅色在左邊，黑色在右邊，小格之running buffer需加到全滿；大格的running buffer之需要加到淹過白金线即可。蓋上上蓋，转到电压那部分，上胶跑90V/70V；下胶跑110V/1