蛋白质浓度测定Folin-酚法.doc

蛋白质浓度测定——Folin-酚测定 实验目的： 熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理： 蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。 实验器材试剂： 标准酪蛋白：200ug/ml Folin-酚乙试剂：乙液：原液：水=1:1:1 Folin-酚甲液： 4%Na2CO3：0.2mol/lNaOH=1:1 A 1%CuSO4:2%酒石酸钾钠=1:1 B A:B=50:1 混匀 血清：稀释200倍 分光光度计 试管（9支） 吸管0.5ml（1支）、1ml（3支） 实验操作： 标准曲线的绘制 将9支干净的试管编号，按下表所示顺序加入试剂并操作。 表1 Folin-酚法测定酪氨酸浓度 试剂管号 1 2 3 4 5 6 A B C 酪氨酸 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 0 血清 0 0 0 0 0 0 0.2 0.2 0.2 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8 Folin-甲 分别加入5ml，混匀后放入30℃水中水浴10min Folin-乙 分别加入0.5ml，混匀后放入30℃水中水浴30min 640nm 0 0.085 0.163 0.223 0.287 0.349 0.216 0.224 0.212 样液测定 将9支试管分别放于分光光度计中测定其吸光度，对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。 实验结果： 1、不同浓度酪氨酸与样液的吸光度 表2 不同浓度酪氨酸与样液的吸光度 管号 1 2 3 4 5 6 A B C 吸光度 0 0.085 0.163 0.223 0.287 0.349 0.216 0.224 0.212 2、标准蛋白分度曲线： 结果分析： 数据分析： 最终所得数据与酪氨酸浓度大致呈一正比的关系，血清的吸光度有着一定的波动,但波动不大，些许误差可能是因系统存在误差。总体而言最终所得数据较为完美。 标准曲线分析： 从曲线中可以看出，反应后溶液的吸光度大致与其浓度成正比例关系。在图中找到血清的平均吸光度的点A，其横坐标（）即为稀释后的血清中蛋白的含量。 思考题： 用酪蛋白测定血清蛋白有无误差？ 答：有。从实验原理中可以得知，蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。即最终用比色法测得的结果与蛋白质（多肽）中酪氨酸与色氨酸的含量成正比例关系。因酪蛋白中酪氨酸与色氨酸的含量 与卵清蛋白中不同，故实验结果存在误差。 另，因等质量的酪蛋白中酪氨酸与色氨酸的总含量明显高于卵清蛋白。故用酪氨酸实验最终绘制的蛋白标准曲线其纵坐标较用卵清蛋白为实验试剂所绘标准蛋白曲线纵坐标高。此结果直接导致血清中蛋白含量的测定值较实际值低。