1 引物设计.doc

引物设计 一 MY Protocal 1 根据基因名称(如USP14)到NCBI Nuclertide 上搜索出相应的基因（人源，鼠源等）的mRNA completely CDS 上的序列(mRNA的)和蛋白序列（字母表示）。分别找到两个序列上的起始密码子和终止密码子。 （1）Origen 序列：mRNA的完整序列，第一个为G(焦磷酸化鸟苷)，最后为AAAAAA（polyA） 如：usp14 1 gtttgaatga gactcgtcgc accgaagccg ccgccaccac cgcgcctccg cctcggccgc 61 cgccgcagct gctcctggtc cccgtccctt tgccgccctc gtcaggccca gctctcctgc 121 gccgccgcct cccgccgcgc cccgccatgc cgctctactc cgttactgta aaatggggaa ……… 1621 gtgaacagta atcttcattt tagtatttat gcttagatgt gaaaataaat gttatttgtt 1681 gatcatttct ataatccaga gctttagagg aagacacata ggtgggttta tgtttcacct ……… 2941 tctgtctcaa aaaaaaaaaa aaaaaa (2) Completely CDS 如：usp14 1 atgccgctct actccgttac tgtaaaatgg ggaaaggaga aatttgaagg tgtagaattg ………… 241 gaaccctcag ccaaaactgt cttcgtagaa gacatgacag aagaacagtt agcatctgct 301 atggagttac catgtggatt gacaaacctt ggtaacactt gttacatgaa tgccacagtt ……… 1381 gaagatatct tacggctttc tggtggtgga gactggcata tcgcttacgt tctactctat 1441 gggcctcgca gagttgaaat aatggaagag gaaagtgaac agtaa （3） 蛋白序列 Translation= M PLYSVTVKW GKEKFEGVEL NTDEPPMVFK AQLFALTGVQ PARQ KVMVKG GTLKDDDWGN IKIKNGMTLL MMGSADALPE EPSAKTVFVE DMTEEQLASAME ………………DDDKVSIVTPEDILRLSGGGDWHIAYVLLYGPRRVEIMEEESEQ 2 准备好你要克隆到的vector的图谱及序列。 例如 要把 USP14克隆到 pflag-CMV2载体上 3 序列的选择： 将上面的original序列或是CDS序列复制到引物设计软件中，如 Primer Premier 2.1. 序列选择 由于DNA只能从5’端-到3’端复制，所以引物定是5’-3’，只能和DNA模板的两条链（DNA1和 DNA2）的5’端配对，如下图所示： F 序列必定和mRNA的5’端相同，和DNA2的5端相同，和DNA1的3’端互补。 R 序列必定和mRNA的3’端互补，和DNA1的5’端相同，和DNA2的3’端互补。 经常PCR的基因在1.5-2kb之间，所以引物的长度选在15-25个之间，（不包括酶切位点，保护碱基，cozk序列长度），长度根据下面的一些原则在15-25之间浮动，来满足下面条件 尽量满足的条件： a 3’末端不要是A b GC含量40-60% c 不能形成引物二聚体 4 酶切位点的选择和保护碱基 (1) 用Primer Premier 分析基因（USP14内部的酶切位点），只要分析载体多克隆位点上的酶切位点是否在usp14基因内部有切点。 pFlang-cmv2 多克隆位点上的酶切位点为： 这些位点在 USP14上有酶切位点有： 没有酶切位点的为：Hind 3， Not1， EcoR1， Bgl2，Kpin1，sal1，Xbal1， BamH1， sma1 酶切位点可选择没有酶切位点的即：除了Cla1， EcoR5， Xbal 外的其他位点 在这些位点中选择： 1好用的酶切位点（见资料中）2 在多克隆位点上分布均匀，不要离的太近，聚一端，或聚中间。3 酶buffer最好是接近的，如都是H buffer，或一个H一个M。4在别