mirRNA引物设计2.docx

miRNA常用实验方法；一、miRNA的检测方法；miRNA的realtime-PCR检测方法；1、realtime-PCR引物设计；miRNArealtime-PCR引物设计方法：；1）stem-loopRT引物设计：基于通用的茎；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG；2）realtime上游引物设计：miRNA序列；3）下游引物是通用的，序列miRNA常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的realtime-PCR检测方法1、realtime-PCR引物设计miRNArealtime-PCR引物设计方法：1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT2）realtime上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。2、miRNA反转录miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补至10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。！！做miRNA的反转录时，注意不要忘记内参的RT，即一个样品至少要做目的miRNA和内参两管反转录反应。3、realtime-PCR实验miRNA逆转录完成后得到的cDNA即可进行下一步PCR。在确认引物的特异性后，我们可以进行正式实验。一般每个样品至少需要3个平行孔。Realtime PCR体系为（ABI定量PCR仪需要加ROX dye II，Biorad定量PCR仪不需要加ROX）：2X SYBR 10 ulROX II 0.4ul （Biorad不加）Primer 1ulTemplate 1ulH2O 7.6ul （Biorad 8ul）需要注意的几点：1）在配制PCR体系时，请一定配制总体系，逐步分装。每步分装前充分混匀。这一点是PCR平行性的保证。2）配制体系尽量在冰上进行。3）请选用比较准确的枪进行体系配制，并注意体系的冗余。一般来说，配制一整个96孔板的PCR体系，我会配制100个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。PCR 程序：95度，1min；95度，5s；60度，34s（此步在读取荧光值）。40到45个循环。4、realtime PCR结果分析realtime PCR反应结束后返回Ct值，可以利用定量PCR仪软件自带的程序进行分析，也可以利用EXCEL表格进行相对定量计算。具体的计算方法：将三个平行孔的数值拷入到EXCEL表格的相应位置，即可自动计算出相对值。注意，第一组样品的值将被默认为归一为1。其他的样品与之相比得出相对值。EXCEL表格公式见附件。二、miRNA靶基因的预测miRNA靶基因预测软件简介1、TargetScan：/首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的miRNA和靶基因，则点击右上角的“Go toTargetScanMouse”。第二个选项可输入基因名（有时不识别别名），点击submit即可，此操作可预测可能靶向该靶基因的miRNA；或者输入miRNA的名字，点击submit，此操作可以预测该miRNA的靶基因。2、Pictar：/输入网址后进入pictar主页，下面有几个可选用的数据库，一般选用最后两个数据库即可。点击进入预测界面。选择物种，选择要预测的miRNA(注意：如果你感兴趣的miRNA在下拉菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件)并点