分子生物学实验操作方法与技巧精要.ppt

纯化小片段DNA（20kb） A.用平衡酚抽取DNA溶液两次。 B.将水相转移至一新管中，加入两倍体积的TE（pH8.0），这一步操作有助于防止寡糖沉淀。 C. 加入0.05倍体积的5M NaCl，随后加入2倍体积的乙醇（指上步中的DNA 终体积）l。置0 ?C 预冷15分钟，微量离心机4 ?C 以最大转速离心15分钟收集沉淀。 D. 小心地吸出乙醇，加入0.5ml 处于室温的70％乙醇。混合均匀，按步骤C所述离心。 E. 吸去上清，打开离心管。置于操作台上数分钟，挥发去除残留乙醇，将DNA溶于适当体积的TE（pH8.0）中。 纯化大片段（20kb） A.将琼脂糖酶消化过的样品移至一透析袋中，扎好或封好后将透析袋放在含100ml TE(pH8.0)的烧杯或三角瓶中。 B. 4 ?C 透析样品数小时。 为防止大片段DNA的断裂损伤，应尽可能避免酚抽提、涡旋以及乙醇沉淀。在透析缓冲液中加入30 ?M 的精胺和70 ?M 的亚精胺可提高大分子DNA的回收效率。 4、凝胶切槽法 1、待各DNA条带在胶上完全分开后，关掉电泳仪，取出胶板，在紧靠目的条带正前方的泳道上用刀片挖一个长方形的小槽，注意切勿将槽的底部挖开，底部应保留一薄层胶。 2、将电泳槽中的缓冲液倒掉（吸取）一些，使得缓冲液不要没过胶表面。将胶板重新放入电泳，在挖好的槽中加满15％PEG4000溶液（以电泳缓冲液配制），用手提式紫外灯实时监控目的条带，直至目的条带完全进入挖好的槽中。 3、关闭电泳仪，用移液器小心将胶槽里的含目的DNA片段的PEG溶液吸出，加入一个新的离心管中。 4、酚：氯仿抽提1－2次。 5、无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤步骤同方法1（有机试剂抽提）中的步骤。 优点：不需LMT Agarose，步骤少，省时间，DNA的纯度和回收率都不错。 缺点：切胶槽需要一定的技术。 ?5、冻融法回收DNA 1、将切好的凝胶切片放入一新的离心管中，加入100－200??l TE,然后用枪头将凝胶捣碎。用线系紧后放入液氮罐（瓶）中速冻（会发出噼啪响声），直到没有响声发出（需几分钟）。取出放室温让其自然解冻。完全解冻后用微量离心机以最大转速离心30 S，将上清液吸出放入一个新的离心管中。 2、剩余的胶中加入50－100 ?l TE，重复一次步骤一的操作，将上清液吸出合并到同一个离心管中。 3、一般2次冻融过程就可以将大部分的DNA回收，如果还需要回收DNA，可继续冻融过程。 4、回收到的上清液进行方法一（有机试剂抽提法）中的无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤过程。 优点：得率高，纯度好，简单，重复性好。 缺点：要用液氮冻融，用冰箱冻效果不好。 6、试剂盒法 优点：简单，得率高，纯度好。 缺点：价格较高。（200元／50次） 推荐品牌：Qiagen，Omega，东盛生物,以后两个性价比最高。 特别推荐产品： E.Z.N.Z. MicroElute Gel Extraction Kit（400元/50次）: 该试剂盒采用超薄的硅胶柱纯化方式，适合于从各种类型或浓度的琼脂糖凝胶中纯化得到高浓度的DNA。每个柱子可用10-15μlElution Buffer洗脱出DNA，从而得到高浓度的核酸。因此此试剂盒特别适用于酶切片段的切胶回收，所得到的高浓度、高纯度的DNA片段用于后续的连接或建库，效果很好！ 电泳切胶小窍门 1.电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。 2.为了减少含有DNA的胶条中凝胶的量，跑样品时应尽量将样品跑在最少的泳道上。如果泳道点样量较小，可以通过采用大孔梳子或用刀片将点样孔从后部扩大容积的方式来解决问题。切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来制胶。 3.关于防护，手上戴上几层一次性塑料手套（最好是薄橡胶手套）在一般有机玻璃后就足够了，如没有有机玻璃挡板，戴上防护面具或防护眼镜保护眼睛也就足够了。 其它的凝胶电泳方法 PAGE凝胶电泳: 分辨率比琼脂糖凝胶要高得多，一般用于DNA测序，小片段核酸的分离、DNA的多态性分析等。 SDS: 蛋白质电泳,Western blot分析。 分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能 电泳技术 李刚 副教授 contents 影响迁移率的几大因素 2 电泳的原理 1 低熔点琼脂糖的优点 3 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 4 电泳缓冲液 5 contents 电泳步骤 7 凝胶载样缓冲液 6 凝胶中DNA定量的方法 8 两种核酸染色方法 9 电泳的主要用处 10 contents 电泳切胶小窍门 12