分子生物学-精要.ppt

核酸分子杂交类型及特点 3．DIG 标记探针的方法 mRNA mRNA mRNA mRNA 正常细胞 mRNA cDNA (红色荧光染料标记的 cDNA) 异常细胞 mRNA cDNA (绿色荧光染料标记的 cDNA) 与芯片杂交 只在正常细胞中表达的基因 只在异常细胞中表达的基因 在正常细胞在异常细胞中等量表达的基因 在正常细胞中高表达的基因 在异常细胞中高表达的基因 在正常细胞在异常细胞中都不表达的基因 DNA 序列测定 DNA 聚合酶 一、双脱氧链终止法 (Sanger 法) 在 DNA 聚合酶的催化下，2’, 3’-ddNTP 底物通过其 5’ -P 基团掺入到延伸的 DNA 链中；由于缺少 3’ -OH，后续 dNTP 不能与其形成磷酸二酯键，导致 DNA 链的合成终止。 DNA 测序过程 退火反应: 使待测 DNA 模板热变性为单链 DNA，与测序引物发生退火。 标记反应: 单链 DNA 模板-引物、dNTP、[?-35S]dATP 和测序酶 (DNA 聚合酶)。 终止反应: 将标记反应混合物分成四组，分别加入含有 ddATP、ddTTP、ddCTP 和 ddGTP 的终止反应液。 电泳: 用变性聚丙烯酰胺凝胶分离新合成的 DNA 片段。 放射自显影: 根据 X-光胶片上条带的位置，读出新合成 DNA 片段的核苷酸顺序，从而得知待测 DNA 链的核苷酸顺序。 * 核酸分子杂交技术 核酸的变性与复性 在某些理化因素作用下，核酸分子中互补碱基之间氢键的断裂叫核酸的变性 (denaturation)。 DNA 发生变性时，DNA 双螺旋解体，变成两条单链； RNA 发生变性时，其分子内部形成的局部双链被破坏，使 RNA 失去原有的空间结构。 使核酸变性的方法： 加热 过量的酸、碱 化学变性剂，如尿素、甲醛、甲酰胺 DNA 变性的本质是 DNA 双链间氢键的断裂。 DNA 变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50% 时的温度为 DNA 的解链温度，又称融解温度 (melting temperature, Tm)。 Tm = 69.3 + 0.41 (%G + C) DNA 解链曲线 在适当条件下，变性 DNA 的两条互补链重新缔合，恢复天然的双螺旋构象，这一过程称为复性 (renaturation)。 DNA 的变性与复性是可逆的过程。 退火 (annealing) 两条互补的 DNA 单链或一条 DNA 单链与其互补的 RNA 链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交 (Hybridization of nuclei acids)。 核酸分子杂交通常是指探针 (probe) 受体 DNA 或 RNA 分子的之间的杂交。 探针是用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸链 (单链 DNA 或 RNA 分子)，用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。 核酸分子杂交 转膜 (印迹) 琼脂糖凝胶电泳 制备受体 DNA/RNA 洗膜 检测探针 制备探针 预杂交 杂交 一、探针的标记 1. 同位素标记的探针 常用的同位素为 32P、35S 2. 非同位素标记的探针 高度灵敏感; 便于检测 利用显色反应、化学发光法、荧光素、若丹明等检测杂交的探针; 探针稳定，并且可被反复使用多次； 不会危害操作者的健康并且不污染环境； 常用的非同位素标记 地高辛 (Digoxigenin, DIG) 生物素 (Biotin) 二、DNA/RNA 样品的制备及电泳 1. DNA 样品 制备基因组 DNA; 限制性内切酶酶切基因组 DNA; 用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组 DNA 2. RNA 样品 制备总 RNA; 用变性琼脂糖凝胶电泳分离 RNA 三、DNA/RNA 从凝胶向膜的转移 - 印迹 (blotting) 转移方法 毛细管转移 (Capillary transfer) 在缓冲液中，DNA 或 RNA 从凝胶中被动地转移到膜上， 用于 Southern 印迹和 Northern 印迹。 真空转移 (Vacuum blotting) 真空加快转移速度，用于 Southern 印迹、Northern 印 迹、斑点或狭缝杂交。 电转移 (Electroblotting) 电流加快转移速度，适用于聚丙烯酰胺凝胶。 膜支持物 (1) 尼龙膜 (Nylon membrane) 带正电荷尼龙膜结合 DNA 及 RNA 的能力大于不带电荷 的