1_质粒DNA的提取酶切及浓度检测.ppt

实验5 质粒DNA的提取 质粒的概念 质粒：质粒是细菌染色体外的遗传物质，大小在1~200kb之间，大多是具有双股闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于细胞浆中。 质粒提取目的 PCR的模板 质粒作为克隆载体 (研究目的基因时，常需要提取质粒) 质粒提取的方法与原理 碱裂解法 SDS裂解法 煮沸裂解法 氯化铯-溴化乙锭梯度离心法 试剂盒法 质粒小抽试剂盒 原理：把硅胶薄膜的优点与经典的碱-SDS裂解细菌细胞法结合起来。 优点：操作简便、节约时间、性/价比高。 使用者需备 10,000xg以上高速离心机 1.5ml的灭菌干净小离心管 灭菌去离子水(或TE缓冲液) 无水乙醇 注意 一、使用前往准备好的SolutionI中加入RNase A， 二、浓缩的Wash Buffer需用乙醇稀释： 三、稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存； 四、所有步骤必须在室温下操作。 实验操作步骤 增殖细菌、扩增质粒 裂解菌体、获取质粒 抽提质粒、分离纯化 结果鉴定 质粒DNA提取范例： * 碱裂解法 溶液1 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液2 0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液1 充分混匀放置3-5分钟; 加入200?l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（变性液），加盖颠倒3-5次使之混匀，冰上放置5min; 质粒小量提取的方法（手工提取）： 加入150 ? l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒3-5次混匀，冰上放置5min; 用台式高速离心机，12000r/min离心15min，上清移入另一干净离心管，并加2倍 100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次， 12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; 加入30-50?l含有20?g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。 注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！ 对于未经酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带 1）（松弛）螺旋状质粒DNA带 2）超螺旋状质粒DNA的带 以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。 质粒DNA的酶切鉴定 1. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。 2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 1)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 II型 限制性内切酶 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。 * *