质粒DNA的提取、酶切及检测.ppt

一、实验目的　　 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 核酸pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。不同分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 　共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 三、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备 凝胶板的制备 加样 电泳 结果观察 　 将0.08g琼脂糖溶解在100 ml的1×TBE电泳液中,配制成0.8%琼脂糖凝胶溶液 当琼脂糖溶液的温度降至60℃～80℃时，加入GoldView I使其终浓度约为0.1μl/ml,混匀后，迅速倾入预先安装好的凝胶板中。 待其凝固后，小心取下梳齿，备用。 加样至样品孔中电泳,调至恒压80v，使DNA向阳性方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。 紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。 Relaxed circle Linearized form Super-coiled form 四、实验结果与讨论 根据观察结果，绘图。 分析自提质粒的情况以及酶切情况。 　　质粒DNA的提取、酶切及检测 　　　　相关知识 基因工程又称DNA重组技术 　外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作 包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程 基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞 　　常用到的工具酶 限制性内切酶 连接酶 聚合酶 逆转录酶 DNA酶和RNA酶 结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 载 体 　　　质　粒（plasmid） 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 　　　　　　　松弛型复制（20个以上） 实验目的和要求 学习和掌握质粒提取的原理与操作、限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。 第一部分　质粒DNA的提取 碱裂解法 　一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。 　二、实验原理 在EDTA存在的条件下，经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。 此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。 而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有蛋白质，实验中加入碱性酚（pH8.0）和氯仿混合液的抽提可以除去蛋白质。 含有质粒DNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。 三、主要试剂 溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； Tris-Cl控制溶液的pH，葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性， 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的相变化所导致。SDS是为下一步操作做的铺垫。 溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。 钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。因为基因组DNA太长了。 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。 平衡酚：氯仿（1：1） 　作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚的比重略比水重，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。 乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA 　　　　四、实验步骤 接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 ? 370C，190rpm振荡培养过夜 ? 取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 12000rpm、离心2s，弃上清，收集菌体 ? 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡