毕业设计（论文）《漆酶的提取纯化及其脱色研究》.doc

PAGE 4 漆酶的提取纯化及其脱色研究 摘 要 【目的】本实验通过选取一株突变的高产漆酶的粗毛栓菌发酵液（培养11天产生漆酶酶活最高），经过离心沉淀过滤，硫酸铵沉淀，Sephadex G-75凝胶过柱层析，分离纯化漆酶以及测定其纯化相关参数，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定各步分离后的成分变化。最后研究其脱色的效果，为漆酶应用的相关研究提供实验依据。【方法】利用过滤，硫酸铵沉淀，Sephadex G-75凝胶过柱层析，的方法提取纯化漆酶，SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定分离成分，并用光密度测漆酶的脱色率。【实验材料】发酵液，相关试剂【预计结果】选用凝胶浓度为12%，结果可以明显看出，经过纯化的漆酶的条带是单一的，相关参数（蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数）比较高，另外，脱色效果比较显著。【结论】 关键词 漆酶 纯化 脱色 应用 1 前言 1.1 实验的研究意义 木质素是植物中产生的一类难于降解的高分子化合物的统称，主要由苯丙烷单元通过醚键和碳键等多种共价键连接而成的杂聚物，是自然界中碳循环的限速环节之一。其降解主要由微生物完成，这类微生物主要包括真菌、放线菌和细菌。其中白腐真菌（white rot fungi）被认为是生物圈中植物天然高分子物质木质素、纤维素和半纤维素的重要降解者，能使这些物质最终分解为二氧化碳和水。白腐真菌通常通过分泌木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）、锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）和漆酶（Laccase，Ec1.10.3.2）三种主要的木质素降解酶类来降解木质素。其中漆酶，能够将木质素降解为CO2和H2O，反应过程不需要H2O2的参与，在木质素降解中起主要作用。 其中漆酶（Laccase）是一种多酚氧化酶（p-diphenol oxidase EC.1.10.3.2），属于蓝色氧化酶家族。漆酶能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类，是一种天然环保型酵素。因而在纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工、生物质能源等领域具有广阔的应用前景，利用漆酶对木质纤维及一些高分子化合物的降解作用，进行合理的开发利用，可减少化学药品的使用量，降低生产成本和保护环境。 本实验通过过滤，硫酸铵沉淀，凝胶层析柱，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法提取纯化漆酶,结果蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数都取得较好的效果，对于漆酶的分离、提纯及其天然结构和生理功能的研究中有重要的作用。漆酶的脱色实验很好的证明了漆酶的重要用途，为漆酶的实用性，工业用途提供了实验平台。 1.2 实验的创新性 在以往的漆酶的提取纯化过程中，要做到蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数同时较高是比较困难的，尤其是最后得到的漆酶不仅酶量少，而且酶活较低。在本实验中，我们经过多步骤纯化，并注意保持其酶活，最后得到的漆酶酶活高，纯度高。 目前，我们从所查阅的大量参考文献中可知，漆酶的脱色反应操作比较困难，主要原因为无法提取纯度较高的酶，或者最后得到的漆酶酶活太低，导致脱色效果不明显。因此，漆酶的脱色反应一直没有被广泛应用。我们设计这个实验以纯化提取为基础，具有可行性强、操作简单、方便等特点。为漆酶的脱色应用的研究提供一个参考实验。 2 实验目的 （1）得出一种能分离，纯化漆酶并保持较高酶活的方法。 （2）完成漆酶的一个重要的应用—脱色反应，为漆酶的实际应用提供实验研究基础。 3 实验原理 3.1 硫酸铵沉淀法 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水集团与水形成水化膜的成都以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当有中性盐加入蛋白质溶液时，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。【*】 3.2 Sephadex G-75凝胶过柱层析 凝胶过滤层析是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，小分子物质能进入其内部，流出速度慢，而大分子物质却被排除在外部，流出速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子大小筛分开。根据查阅相关文献，粗毛栓菌主要漆酶的表观分子量为61.5KD【*】，因此，本试验采用Sephadex G-75（葡聚糖凝胶G-75）填料，孔径相对分子量范围2 kD~70 kD。 3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以丙烯酰胺为单体，N，N’-甲叉丙烯酰胺为交联剂，在催化剂（过硫酸铵）和引发剂（TEMED）的作用下，聚合成含酰