淀粉酶产生菌的筛选、诱变选育及产酶条件优化研究教案详解.ppt

2．接种 挑取斜面菌苔5环接入5ml无菌水中，摇匀后用无菌移液管吸取0.5ml菌悬液，接到每一组培养基中。30℃、200r/min摇床培养48h左右。 3．酶活测定 参照实验二方法，获得最优培养基配方。 4.以上面最优培养基为基础，采用单因素优化实验或正交设计实验，获得最佳温度、起始pH和溶氧（转速、装液量、纱布层数），发现最优发酵工艺条件。 大实验结束，清点回收仪器，提交实验报告。 谢谢大家！ 淀粉酶产生菌的筛选、诱变选育及产酶条件优化研究 江西师范大学生命科学学院生物工艺组 赵喜华 淀粉酶概况 淀粉分直链和支链淀粉。 淀粉酶是水解淀粉一类酶的统称，能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖。 淀粉酶分为α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）等。 主要来源于根霉、曲霉、青霉、芽孢等菌属。 淀粉酶的应用 实验内容 建立高产淀粉酶产生菌初筛方法 建立高产淀粉酶产生菌复筛方法 建立淀粉酶酶活测定方法 建立高产淀粉酶菌诱变育种方法 建立高产淀粉酶产生菌产酶条件优化方法 实验目的 掌握淀粉酶产生菌初筛方法 掌握淀粉酶产生菌复筛方法 掌握淀粉酶酶活测定方法 掌握紫外诱变育种方法 掌握微生物产淀粉酶条件优化方法 实验一 淀粉酶产生菌的筛选 培养基制备 配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。 配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。 将融化的初筛平板培养基冷却至50-60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。冷却凝固待用。 倒平板 取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。 用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。 样品预处理 分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24-48h。 涂布 初筛平板长出菌落后，挑取不同菌落进行编号保存。 将检测试剂（碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株，取水解圈大的菌株进行下一步实验。（本次实验应有照片及水解圈直径表格作为结果） 初筛 初筛结果 菌编号 菌落直径（d） 透明圈直径（D） D/d值 1 2 3 4 5 6 7 8 初筛结果 保存菌种 将得到的菌株转接至斜面培养基上（每组转接2株，每株保存3支），30℃培养48～72h，待菌苔长好后于4℃保存。 实验二 高产淀粉酶产生菌复筛及酶活测定 功能性平板筛选具有简便、快速并节约大量时间等优良特性，但难以得到确切产量水平，只适合初筛。 初筛具有不稳定性，有必要进行摇瓶复筛，定量确定表达水平，获得优良性状菌株。 高产淀粉酶产生菌的摇瓶复筛 诱导培养基配制 可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，水 1000ml 接种 取斜面，倒入无菌培养基，用无菌接种针打散斜面上的菌苔，再倒回装有无菌培养基（1%葡萄糖代替可溶性淀粉）的三角瓶中进行培养24小时，以10％接种量接种到诱导培养基进行扩大培养48小时。 离心 8000r、5min离心发酵液，取上清液。 固液转接 固液转接 固液转接 固液转接 液液接种 液液接种 液液接种 液液接种 （250ml，装液50ml） 10%接种量，50ml接5ml 30℃培养48h 淀粉酶诱导表达 葡萄糖标准曲线绘制 试管编号 1μg/μL葡萄糖标准液体(μL) 蒸馏水(μL) DNS(μL) 平均OD540 1 100 1900 2000 2 200 1800 2000 3 300 1700 2000 4 400 1600 2000 5 500 1500 2000 6 600 1400 2000 DNS法测淀粉酶酶活。 将6个试管于沸水中反应10min后迅速冷却，取2mL反应液再加入4mL蒸馏水，通过比色皿于540nm处测定吸光度。以葡萄糖量（μg）为y轴和吸光度为x轴，再采用origin7.5软件获得回归曲线。 淀粉酶酶活测定步骤 试管A（空白） 试管B ↓ ↓ 加淀粉液含缓冲液1.5mL 加淀粉液含缓冲液1.5mL ↓ ↓ 取2mL DNS 加入0.5mL稀释粗酶液 ↓ ↓40±0.2℃，3