实验五枯草杆菌蛋白酶活力测定.doc

实验五 枯草杆菌蛋白酶实验目的1.加深了解酶活力的概念。2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。三、 仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料 枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。试剂 1. Folin-酚试剂： 在2 L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4?. 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4?. 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?. 12H2O) 7.16g，用水定容至100 mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O) 3.12g，用水定容至100 mL (B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到0.2 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取12.5 mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2 mol/L 盐酸约30 mL 溶解后，蒸馏水定容至250 mL。8. 酪蛋白溶液(0.5%)：称取1.25 g 酪蛋白，用0.04 mol/L 氢氧化钠溶液(20 mL)溶解，再用0.02 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液定容到250 mL。四、操作步骤(一)酪氨酸标准曲线的制作取6支试管(标号0，1~5)，按顺序分别加入0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL 标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后各加入0.55 mol/L 碳酸钠5.0 mL，摇匀。依次加入Folin—酚试剂1.00 mL，摇匀并计时，于30℃水浴锅中保温15 min。然后680 nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。(二)酶活力测定1.酶反应：取一支试管，加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30℃水浴中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。另取一试管，先加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。以上两过程，应各做一次平行实验。2.滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管，分别加入1.0 mL 水、A 液、B 液，然后各加入5.0 mL 0.55 mol/L 碳酸钠溶液和1.00 mL Folin-酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。五、计算A 样品—样品液的吸光度值A 对照—对照液的吸光度值K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数V—酶促反应液的体积(本实验为5mL)T—酶促反应时间(本实验为10min)N—酶溶液稀释倍数