蛋白酶活力的测定.docx

QB/TXXX—20XX

蛋白酶活力的测定

1范围

本文件规定了酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定方法。本文件适用于酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

3.1

中性蛋白酶活力单位neutralproteaseactiveunit

在温度为40℃、pH值为7.2的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1

个中性蛋白酶活力单位。

3.2

酸性蛋白酶活力单位acidicproteaseactiveunit

在温度为40℃、pH值为3.0的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1

个酸性蛋白酶活力单位。

3.3

碱性蛋白酶活力单位alkalineproteaseactiveunit

在温度为40℃、pH值为10.5的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1个碱性蛋白酶活力单位。

4原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，可将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。采用分光光度计（波长660nm）测定其吸光度，进而计算蛋白酶活力。

5试剂和材料

5.1试剂

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。

5.1.1钨酸钠（Na2WO4·2H2O）。

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5.1.2钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）。

5.1.3硫酸锂（Li2SO4）。

5.1.4溴（Br）。

5.1.5无水碳酸钠（Na2CO3）。

5.1.6三氯乙酸（CCl3COOH）。

5.1.7磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H20）。

5.1.8硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）

5.1.9磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。

5.1.10干酪素。

5.1.11氢氧化钠（NaOH）。

5.1.12酪氨酸（C9H11NO3）。

5.1.13盐酸（HCl）。

5.1.14乳酸（C3H6O3）。

5.1.15乳酸钠（C3H5NaO3）。

5.2试剂配制

5.2.1福林试剂（Folin试剂）：可购买市售产品或自行配制，配制方式为：于2000mL磨口回流装置内，加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸160mL，文火回流10h。取去冷凝器，缓慢加入硫酸锂（Li2SO4）50g（防止过热状态下加入硫酸锂反应剧烈，导致溶液喷出）、水50mL，混匀，加入2～3滴液溴，再煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加2～3滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000mL，用细菌漏斗（No4～5）或中性滤纸过滤，置于棕色瓶中保存，有效期为1年。此溶液使用时加2倍水稀释，即成已稀释的福林试剂，现配现用。

5.2.2碳酸钠溶液（0.4mol/L）：称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，定容至1000mL。

5.2.3三氯乙酸（TCA）溶液（0.4mol/L）：称取三氯乙酸（CCl3COOH）65.4g，定容至1000mL。

5.2.4磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.2）：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H20）31.2g，定容至1000mL，即成A液。称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.63g，定容至1000mL，即为B液。取A液28mL和B液72mL，再用水稀释1倍，即为磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.2）。

5.2.5乳酸-乳酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH3.0）:称取80%～90%乳酸10.6g，定容至1000mL，即成A液。称取70%乳酸钠16g，定容至1000mL，即为B液。取A液16mL和B液1mL，再用水稀释1倍，即为乳酸-乳酸钠缓冲液（0.05mol/L，pH3.0）。

5.2.6硼砂-氢氧化钠缓冲液（0.025mol/L，pH10.5）：称取硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）9.54g，氢氧化