裂殖壶菌细胞破壁工艺的研究.doc

裂殖壶菌细胞破壁工艺的研究 何文胜1, 2*，王 灿2，杨诗颖2 （福建 福州 350福建师范大学 工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心福建 福州 350117） 对其进行充分破壁是工序。裂殖壶菌细胞的，方法得到的油脂含量，裂殖壶菌的效果提高油脂得率，碱性蛋白酶酶解条件进行优化表明pH 10，酶解时间2 h。在此条件下，裂殖壶菌油脂提取量达到0.4586 g/g 中图分类号 TQ 920.6 文献标志码：A DHA（Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸）是一种重要的ω-3[1-2]，具有增强记忆力、提高智力、降低血压和血脂、预防老年痴呆[3-4]、延缓衰老[5]等功能，是一种重要的功能保健因子6]。裂殖壶菌Schizochytrium sp. FJU-512，是本实验室分离获得的一株具独立知识产权的DHA 高产菌株[7]。该菌株生长速度较快，脂肪酸组成简单，DHA 含量高且易纯化[8]，可作为DHA油脂相关研究的优势菌株合适[9-10]。目前在DHA的实际生产中，主要采用高压匀质等技术进行细胞破碎以释放胞内油脂，但高压匀质单次破壁效果差，必须进行多次重复操作，容易造成匀质机损耗严重，影响大规模连续作业[11]。 本课题组选取多种不同的细胞破碎方法用于破碎裂殖壶菌胞体，通过对比油脂提取量，并权衡实际工业生产的可操作性，确定裂殖壶菌的最适破壁方法，优化破壁工艺条件，以期为DHA的工业化生产提供一定的技术支持。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 裂殖壶菌Schizochytrium sp. FJU-512菌株由本课题组保藏，菌粉来源于15 L发酵罐发酵后收取，6 000 r/min离心取菌体沉淀，-80 ℃冻干菌体即得菌粉。 1.1.2 试剂 氢氧化钠（AR），碳酸钠（AR），盐酸（AR），乙醇（AR），正己烷（AR）：国药集团化学试剂有限公司；碱性蛋白酶：Ruibio，比酶活≥200 U/mg；中性蛋白酶：Ruibio，比酶活≥100 U/mg；纤维素酶：Ruibio，比酶活≥30 U/mg；β-葡聚糖酶：Ruibio，比酶活≥3 000 U/mg。 1.1.3 仪器 高压灭菌锅：上海博迅实业有限公司；双层全控温摇床：上海智诚分析仪器有限公司；高速台式冷冻离心机：Beckman Coulter；紫外分光光度计：Amersham Bioscience；循环水多用真空泵：郑州长城工贸有限公司；恒温培养箱：上海智诚分析仪器有限公司；超级恒温水槽：上海一恒科技有限公司；冻干机：美国LABCONCO 公司FreeZone系列冷冻干燥机。 1.2 方法 1.2.1 细胞破碎方法 1) 酸热法：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL 30%的浓盐酸，重悬菌体，80 ℃恒温水浴1 h。 2) 碱热法：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL pH 10的复合碱液（氢氧化钠:碳酸钠=10:1），80 ℃恒温水浴2 h。 3) 超声波法：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL单蒸水重悬菌体，置于400 Hz下超声4 s，间隔4 s，持续1 h。 4) 酶法破碎：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL pH已调为10单蒸水重悬菌体，酶（碱性蛋白酶）用量2 %，50 ℃恒温水浴酶解2 h。 1.2.2 油脂提取方法 破壁待冷却后加0.75 mL无水乙醇与2 mL正己烷，充分摇匀，1200 r/min离心2 min，萃取油脂，取上清于已知重量的螺口管中。重复上述操作充分萃取油脂 2 结果 2.1 不同破碎方法对油脂提取的影响 Schizochytrium sp. FJU-512菌粉为材料，采用4种不同的细胞破碎方法（酸热法、碱热法、超声波法、酶法）对其进行破碎，各种破碎方法获得的油脂量如图1所示，其中酶法和碱热法破碎细胞效果最好，油脂量分别达到0.4535 g/g和0.4466 g/g，其次为酸热法，而超声波法破壁效果相对较差。酶法作用条件温和内含物成分 图1 各种不同的细胞破碎方法获得的总油脂及DHA产量 Fig 1 Effects of different cell disruption methods on total lipid and DHA yields 碱热法破碎主要是利用强碱对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和蛋白质）的作用，改变其，，，释放[12]。酶溶法是一种研究较广的方法，利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键而达到破碎并释放油脂的目的[13]，即利用能溶解细胞壁的酶，如蛋白酶，纤维素酶等，处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或者完全破坏之后，进而破坏细胞膜结构，增加胞内外的通