《蛋白质的表达纯化》课件.ppt

蛋白质的表达纯化本课件旨在全面介绍蛋白质表达与纯化的核心技术与方法。我们将从基因克隆与载体构建入手，深入探讨不同表达系统的特点与选择依据，以及表达条件的优化策略。同时，还将详细讲解蛋白质纯化的基本原则与流程，包括样品准备、层析技术、蛋白质鉴定与浓度测定等关键环节。通过本课程的学习，您将掌握蛋白质表达纯化的理论知识与实践技能，为生物学研究和药物开发奠定坚实基础。

课程介绍：蛋白质的重要性及应用蛋白质的重要性蛋白质是生命活动的基础，参与细胞结构、酶催化、信号转导、免疫防御等多种生物过程。其功能的多样性决定了蛋白质在生命科学研究中的核心地位，是理解生命现象的关键分子。蛋白质的应用蛋白质在医药、农业、工业等领域具有广泛应用前景。例如，蛋白质药物的开发，酶制剂在工业生产中的应用，以及蛋白质在生物材料和生物传感器中的应用等。课程目标本课程旨在帮助学生掌握蛋白质表达纯化的基本原理和实验技能，为未来的科研工作打下坚实基础。

表达纯化的目的和意义1研究蛋白质功能通过表达和纯化，可以获得高纯度的蛋白质样品，为后续研究其生物学功能、结构和相互作用提供基础。2药物开发许多药物靶点是蛋白质，通过表达纯化可以获得靶标蛋白，用于药物筛选、药效评估和机制研究。3工业应用工业生产中需要大量的酶制剂，通过表达纯化可以大规模生产所需的酶，用于食品、纺织、洗涤等行业。

基因克隆与载体构建PCR扩增目的基因利用PCR技术从DNA模板中扩增出目标基因片段，为后续的克隆和表达奠定基础。引物设计是关键，需保证特异性和扩增效率。酶切与连接使用限制性内切酶切割目的基因和载体，然后通过DNA连接酶将两者连接起来，构建重组DNA分子。转化与筛选将重组DNA分子转化到宿主细胞中，通过筛选标记筛选出含有目标重组子的细胞。

表达载体的选择原则启动子强度选择强启动子可以提高蛋白质的表达水平，例如T7启动子、lac启动子等。标签选择合适的标签（如His标签、GST标签）可以方便蛋白质的纯化和检测。抗性选择带有抗生素抗性基因的载体，方便筛选含有重组子的宿主细胞。

原核表达系统介绍(E.coli)优点生长快速、培养成本低廉、遗传背景清晰、易于操作和大规模培养。缺点不能进行真核蛋白的正确折叠和翻译后修饰，容易形成包涵体。常用菌株BL21(DE3),DH5α,Rosetta等。

酵母表达系统介绍(Pichiapastoris)优点具备一定的真核蛋白翻译后修饰能力，表达水平较高，分泌表达方便纯化。1缺点糖基化修饰与哺乳动物细胞不完全相同。2常用菌株GS115,KM71H等。3

昆虫细胞表达系统介绍(Sf9,HighFive)1优点真核蛋白翻译后修饰能力较强，表达水平较高。2缺点培养成本较高，操作相对复杂。3常用细胞Sf9,HighFive等。

哺乳动物细胞表达系统介绍(CHO,HEK293)1优点能够进行正确的真核蛋白翻译后修饰，表达的蛋白活性较高。2缺点表达水平较低，培养成本高昂，周期长。3常用细胞CHO,HEK293等。

无细胞表达系统简介优点表达速度快，可表达有毒蛋白，易于操作和控制。缺点成本较高，表达量较低，难以进行翻译后修饰。应用高通量筛选，蛋白相互作用研究等。

表达宿主的选择依据1目标蛋白特性是否需要翻译后修饰？是否对宿主细胞有毒性？2表达量需求需要多大的产量？3成本考量预算多少？4时间限制需要在多长时间内完成？

表达条件的优化策略温度优化培养温度以提高蛋白质的表达水平和溶解度。诱导剂优化诱导剂浓度和诱导时间以获得最佳表达效果。培养时间优化培养时间以确保蛋白质充分表达。

温度对表达的影响温度对蛋白质表达有显著影响。一般来说，在一定范围内，随着温度升高，蛋白质表达水平也会升高。但过高的温度会导致蛋白质错误折叠甚至降解。因此，需要根据目标蛋白的特性选择最佳的培养温度。

诱导剂浓度对表达的影响诱导剂的作用诱导剂用于激活表达载体上的启动子，启动目标基因的转录和翻译。常用的诱导剂包括IPTG、阿拉伯糖等。浓度依赖性诱导剂浓度过低可能无法有效启动表达，浓度过高可能导致细胞毒性或蛋白质错误折叠。因此，需要优化诱导剂浓度以获得最佳表达效果。

培养时间对表达的影响1早期细胞生长迅速，但蛋白质表达水平较低。2中期蛋白质表达水平达到高峰。3后期蛋白质开始降解，细胞活力下降。培养时间对蛋白质表达也有重要影响。过短的培养时间可能无法获得足够的蛋白质，而过长的培养时间可能导致蛋白质降解或细胞死亡。因此，需要根据目标蛋白的特性选择最佳的培养时间。

添加剂对表达的影响甘油增加培养基的粘稠度，保护细胞免受机械损伤，提高蛋白质的溶解度。金属离子某些金属离子是某些酶的辅因子，添加合适的金属离子可以提高酶的活性。分子伴侣辅助蛋白质正确折叠，提高蛋白质的溶解度。

蛋白质溶解度的影响因素1氨基酸序列蛋白