地高辛试剂盒说明书1.doc

PAGE 1 仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用 只能在体外使用 地高辛DNA标记和检测试剂盒1 和NBT/BCIP一起用于颜色检测 通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测 货号：11 745 832 910 此试剂盒储存条件-15oC—-25oC 此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应 可检测100cm2面积的杂交膜24张 指导手册 2009.11版 1前言 1.1内容表 1前言2 1.1内容表2 1.2试剂盒内容3 2简介5 2.1产品概述5 3步骤和所需材料8 3.1开始之前8 3.2地高辛DNA标记9 3.3 标记效率的测定11 3.4 DNA 的转移和固定14 3.5杂交16 3.6免疫检测18 3.7 DNA印记的洗脱和再杂交20 4结果21 4.1典型的结果21 5附录23 5.1故障排除23 5.2引用24 5.3订购信息25 1.2 试剂盒内容 瓶/杯号 标签 内容 包括功能 1 地高辛高效引物 50ul地高辛高效引物 5×标记的混合物的浓度，包括随机引物，核苷酸，DIG-dUTP(碱标记的)，Klenow酶和缓冲液混合的最佳浓度。 随时可用 澄清的粘液 用于DNA的高效随机引物标记 2 DIG标记的对照DNA 20ul （5ug/ml ）PBR328 DNA（用Bam HI 线性化） 澄清溶液 用于确定标记效率 3 DNA稀释缓冲液 3×1ml （50ug/ml 鱼精DNA在10mM Tris-HC中，1mM EDTA ;在25oCpH8.0 ） 澄清溶液 4 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物 100ul （750U/ml） 从羊，Fab段，结合碱性磷酸酶中获取的 澄清溶液 5 NBT/BCIP 6×1ml 50×浓度的原溶液（即67%（v/v）的DMSO中含有18.75mg/ml硝基氯化四氮唑蓝和9.4mg/ml 5 -溴- 4 -氯-3-吲哚磷酸盐 可以在浅黄色和棕色之间变化，澄清溶液 与碱性磷酸酶反应 6 封闭液 4×100ml 10×浓度 黄色，粘液 7 地高辛杂交颗粒 准备4×100ml（为17页做准备） 杂交液 附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 在每个操作程序的前面提供了详细的信息 操作程序 仪器设备 试剂 3.2 DIG-DNA标记 水浴 灭菌的双蒸水 0.2M pH8.0 灭菌的EDTA 3.3 标记效率的半定量测定 带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封组缓冲液组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 TE缓冲液 3.4 DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备 20×ssc 或者10×ssc 3.5 杂交 尼龙膜，带正电荷* 杂交袋* 或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶 注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘 3.6 免疫检测 容器大小与滤器大小相适应 杂交袋* 地高辛洗涤和封组缓冲液组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 TE缓冲液 3.8 DNA 斑点的脱色和重新标记探针 大的托盘 水浴 10×ssc 10%SDS 0.2M NaOH *标记的产品可以从Roche Applied Science 获得 2 介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原， 去标记DNA探针从而通过酶免疫分析法用于杂交和后续的颜色检测（1） 步骤 描述 DNA标记 根据随机引物标记技术采用地高辛标记的高效引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的产物混合物，其中，含有地高辛dUTP，碱性标记（图2）和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先优化的5×浓度反应缓冲液 杂交 根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交 免疫检测 杂交探针可以和抗地高辛的碱性磷酸酶结合物和Fab段进行免疫检测，然后采用比色底物NBT/BCIP可以看到杂交结果。 应用 地高辛标记DNA探针可以用于： 所有类型的滤膜杂交 总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行 检测，如人，大麦和小麦。 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者λDNA 超螺旋的DNA