疟原虫镜检技术操作规范2.doc

疟原虫镜检技术操作规范 疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。 一、血片制作 （一）所需器材 载玻片 玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用） 采血针 采用一次性采血针。 玻片盒 存放50或100片玻片的木质或塑料盒。 皮肤消毒液、棉签或酒精棉球 75%的酒精、安尔碘 、碘伏等皮肤表面消毒剂。 记号笔 用于玻片上书写血检病人基本信息。 （二）操作步骤 1、载玻片基本信息登记 取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期 结果（镜检结束后补写）。载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。如图1 2、采血 采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。 3、涂制血膜 用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。如（图1）、（图2） 疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2 薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。 二、固定 （一）所需器材 1、甲醇 2、器具 玻璃棒、吸管 （二）操作步骤 薄血膜固定 薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。 三、染色 （一）所需器材 1、吉氏染液（原液） 2、器具 染色用的盘子、染色缸、烧杯、吸管若干。 3、染色及冲洗用水 蒸馏水、冷开水、自来水、pH7.2缓冲液。 （二）操作步骤 单片染色 单张血膜染色可取蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水或pH7.2的缓冲液1ml加入吉氏染液原液1-2滴，混合均匀后浓度约为2～5％的吉氏稀释液，均匀滴在厚、薄血膜上，染色20～30分钟。 注意：1、浓度约为2～5％的吉氏稀释液现配现用；2、新鲜厚血膜充分干燥后才能染色；3、厚、薄血膜一起染色。 多片染色：用吉氏染液成批血膜染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2～5％吉氏染液(2ml吉氏原液与98ml蒸馏水缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入pH7.2缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2～3次，然后取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。 四、冲洗 染色后不要将玻片上残余染液直接迅速倒掉，应将玻片连同玻片上的染液一起放在水中轻轻漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。 五、镜 检 （一）器材 1、显微镜 单、双目显微镜均可，目镜一般以5X为宜（有的用10X），物镜必须用油镜（100X）。 2、镜油 3、擦镜纸 4、二甲苯或酒精乙醚 （二）操作步骤 1、血膜上滴加镜油 滴一滴镜油在血膜上，再将血片置载物台上。 2、镜检 用目镜5×和物镜10～40×低倍镜检下找到血膜，再将物镜转换成油镜（100×），查找疟原虫，吉氏染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。 3、观察血膜的方法 镜检时从血膜的一端开始，自上而下，自左而右，逐个视野顺序查看。发热病人血片至少要查完200个视野以上，普查带虫血片则需看完全片，方可报告结果。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜作为疟原虫的分类定种。 5、结果报告 结果报告分阳性和阴性，阳性者至少要查见一个典型疟原虫（并需鉴别虫种和期别）方可确定；以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。 五、注意事项 1、染色前血膜的保存 新制作的血膜应防止污染和苍蝇吸食血膜，新鲜厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥后可不溶血直接染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能即时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，