血清碱接性磷酸酶活力测定.ppt

血清碱性磷酸酶活力测定 (磷酸苯二钠法) 酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。 酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。 底物减少量或生成物增加量 酶促反应速度= 单位时间 酶的活力单位 国际单位：Katal，1s转化1mol底物的酶量 临床表示：Kings，如血清谷丙转氨酶活力单位，每100ml血清在37℃。pH=7.4的条件下与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位 酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活力单位数，即酶活力浓度。 酶活力的测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法） 实验目的 熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义 实验原理 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。 磷酸苯二钠+H2O 苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物 实验器材和试剂： （一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级标准品。 实验操作 1.取试管4支，按下表操作 计算 ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白）*0.05*100(金氏单位） 临床意义： 血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。 1．血清ALP活性升高可能原因如下 ：①肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。 2．血清ALP活性降低比较少见： 主要见于呆小病、重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。 注意事项 目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久置 底物液中不应含有酚，如空白管显红色，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。 加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则对实验结果会有影响。 标准曲线法 制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液(1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。 * * ALP pH=10 铁氰化钾 0.100 —— ——— —— 血清 3.00 3.00 3.00 3.00 铁氰化钾溶液 混匀，37℃水浴保护15min 1.00 1.00 1.00 1.00 底物液 混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 1.00 1.00 1.00 1.00 pH10碳酸盐缓冲液 —— 0.100 —— —— 蒸馏水 —— —— 0.100 —— 酚标准液 —— —— —— 0.100 血清（ml） 对照管 空白管 标准管 测定管 2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。