树鼩载脂蛋白AV基因的克隆表达和纯化-中国动脉硬化杂志.PDF

CN43鄄1262/ R摇 中国动脉硬化杂志2013年第21卷第9期 775 [文章编号]摇 1007鄄3949(2013)21鄄09鄄0775鄄05 ·实验研究 · 树鼩载脂蛋白AV基因的克隆、表达和纯化 1 2 2 2 1 2 王 艳 ,李国平 ,满 永 ,王 抒 ,涂 萍 ,黎 健 (1.南昌市第三医院内分泌代谢科,江西省南昌市330009; 2.卫生部北京医院卫生部北京老年医学研究所 卫生部老年医学重点实验室,北京市 100730) [关键词]摇 树鼩;摇 载脂蛋白AV;摇 原核表达;摇 蛋白纯化;摇 His标签 [摘摇 要]摇 目的摇 构建树鼩载脂蛋白AV原核表达载体并利用His标签纯化该蛋白。 方法摇 从树鼩肝细胞中提取 总RNA,经逆转录合成cDNA 第一链,以cDNA 第一链为模板,扩增载脂蛋白AV基因。 PCR扩增产物和pET32a原 核表达载体经过双酶切,将纯化回收的酶切产物按适当的摩尔比通过T4 DNA连接酶16益连接过夜,连接产物转 化大肠杆菌感受态细胞Top10,挑克隆测序。 将克隆成功的载脂蛋白AV 重组质粒转化大肠杆菌表达菌株 BL21 (DE3),利用异丙基鄄茁鄄D鄄硫代半乳糖苷诱导表达,并优化诱导条件。 表达的载脂蛋白AV 经镍离子螯合树脂纯化, 采用BCA 法分析蛋白浓度,纯度测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合薄膜凝胶扫描分析获得。 结果摇 挑选的克隆 经测序证实载脂蛋白AV基因已经成功连接入pET32a原核表达载体中。 在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基鄄茁鄄D鄄 硫代半乳糖苷诱导表达,有分子量大小约60 kDa的特异性蛋白产生,与预期大小一致。 重组蛋白诱导的最佳表达 时间为5 h左右,最佳浓度约在20 滋mol/ L。 镍离子螯合树脂柱亲和层析获得的纯化蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电 泳后薄膜凝胶扫描分析显示目的蛋白的纯度在95%以上。 结论摇 成功构建了载脂蛋白AV 的原核表达载体,该蛋 白在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化后的载脂蛋白AV 纯度约95%,为进一步研究其结构与功能奠 定了基础。 [中图分类号]摇 Q71 [文献标识码]摇 A Cloning,Expression and Purification of Tree Shrew Apolipoprotein AV 1 2 2 2 1 2 WANGYan ,LI Guo鄄Ping ,MAN Yong ,WANG Shu ,TU Ping ,and LIJian (1.Department of Endocrinology andMetabolism,The third Hospital of Nanchang,Nanchang,Jiangxi330009,China; 2.Beijing Hospital Beijing Instituteof GeriatricsMinistry of Health Key Laboratory of GeriatricsMinistry of Health,Bei鄄 jing 100730,China) [KEY WORDS]摇 Tree Shrew;摇 Apolipoprotein AV;摇 Prokaryotic Expression;摇 Protein Purification;摇 HisTag [ABSTRACT]摇 摇 Aim摇 To construct recombinant plasmid pET32a鄄apolipoprotein AV and purify the