2018年大鼠外周血淋巴细胞分离方法.doc
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大鼠外周血淋巴细胞分离方法
1.实验前准备
2.使用方法说明及图例
2.1血液样本分离液使用说明及图例
3.HES-TBD550使用说明
4.注意事项
5.性能指标
6.细胞计数方法与要点
7.初学者易犯的错误
8.生产企业
9.参考文献
1. 实验前准备
A．试剂
大鼠外周血淋巴细胞分离液、全血及组织稀释液、细胞洗涤液、羟乙基淀粉550、胎
牛血清
B．器材
玻璃离心管、玻璃滴管
水平转子离心机、无菌工作台
2. 使用方法说明及图例
2.1 血液样本分离液使用说明及图例
A. 小量分离-使用1-2ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：
a. 取新鲜抗凝血1-2ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀；
b. 小心加于与混合液等体积的细胞分离液（货号：LTS1083）之液面上；
c. 以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；
第二层细胞放入含4-
5ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心
20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。B. 中量分离-使用5-10ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：
a. 取新鲜抗凝血5-10ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀；
b. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）；
c. 以500g（约1800转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；
第二层细胞放入含10ml
细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20
分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。C. 大量分离I-使用20ml新鲜抗凝血（分离图例见图例2）：
a. 取新鲜抗凝血20ml以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去血浆；
b. 向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）12ml 小心混匀；
c. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）；
d. 以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；
第二层细胞放入含20ml
细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20
分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。D. 大量分离II-使用50ml新鲜抗凝血（分离图例见图例3）：
a. 取新鲜抗凝血50ml
30分钟。吸取混浊的上清液备用，弃去底部红细胞。
b. 将步骤1中留取的上清液以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去上清保留沉淀细胞；
c. 向沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）20ml 小心混匀；
d. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）；
e. 以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；
收集第二层细胞放入含20ml
细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20
分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。
注：提取率大于90%。
?血液（人）中各细胞含量参考值：红细胞男：4.0-5.5×1012/L(400-550万个/mm3)
白细胞
血小板
白细胞分类计
数女：3.5-5.0×10
12
/L(350-500万个/mm3)新生儿：6.0-7.0×1012/L(600-700万个/mm3)成人：4.0-10.0×109/L(4000-10000个/mm3)新生儿：15.0-20.0×109/L（15000-20000个/mm3)100-300×109/L（10万-30万个/mm3)名称占白细胞总数百分比嗜中性粒细胞30%-70%嗜酸性粒细胞0.5%-5%嗜碱性粒细胞0%-1%
淋巴细胞20%-40%
单核细胞3%-8%
分离图例3
抗凝血50ml与HES-TBD550 1：1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20-30分钟
3. HES-TBD550使用说明
HES
是从支链淀粉衍生出来的，是富含淀粉的复合物，其生理和化学特性主要由羟乙基取代度
即取代级、平均分子量决定。大量实验表明平均分子量越大对红细胞的凝集作用越强，有
效提高红细胞的沉降速度，从而使红细胞与其
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