验证报告2-蜂蜜中氯霉素和甲硝唑残留量的测定 液相色谱-串联质谱法.docx
蜂蜜中氯霉素和甲硝唑残留量的测定液相色谱串联质谱法验证报告
1.目的：完成《蜂蜜中氯霉素和甲硝唑残留量测定液相色谱串联质谱法》方法
验证。
2.材料准备
2.1验证基质信息：本方法涉及1种基质：蜂蜜
2.2验证目标物：氯霉素、甲硝唑
2.3材料与方法
2.3.1仪器设备
(1)液相色谱-质谱联用仪(WatersAcquityUPLC-TQ)
(2)分析天平
(3)涡旋混合器
(4)冷冻离心机：转速不低于10000r/min
(5)超声仪
2.3.2试剂与材料
(1)乙腈：色谱纯
(2)乙酸铵：色谱纯
(3)PTFE微孔过滤膜：0.22μm
(4)C18和NH2双层复合固相萃取柱
(5)标准溶液：氯霉素标准溶液、甲硝唑标准溶液、D5-氯霉素标准溶液、D4-
甲硝唑标准溶液
(6)标准物质名称：蜂蜜中甲硝唑残留分析标准物质；参考样来源：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所；标准物质编号GBW(E)100568;
有效期24个月(定值日期：2022年9月);批号568202209标
准值13.7±1.7(μg/kg)
(7)试验用水为符合GB/T6682的一级水
3.实验方法
3.1仪器条件
3.1.1液相色谱条件
(1)色谱柱：WatersBEHC18柱，100mm×2.1mm,粒径1.7μm或性能相当者
(2)流速：0.25mL/min
(3)柱温：40℃
(4)进样量：5μL
(5)流动相：A=5mM乙酸铵水溶液，B=乙腈溶液
(6)梯度洗脱条件见表1.
表1液相梯度洗脱程序
时间(min)
流动相A
流动相B
初始
95
5
0.5
95
5
3
0
100
4
0
100
5
95
5
3.1.2质谱条件
离子源参数
甲硝唑
模式：
ES+
喷雾电压(KV)
3
锥孔电压(V)
38
离子源温度(℃)
500
脱溶剂气流量(L/Hr)
1000
锥孔反吹气流量(L/Hr)
150
雾化气压力(bar)
7
氯霉素
模式：
ES-
喷雾电压(KV)
1.5
锥孔电压(V)
40
离子源温度(℃)
500
脱溶剂气流量(L/Hr)
100C
锥孔反吹气流量(L/Hr)
150
雾化气压力(bar)
7
检测方式：MRM(多反应监测),参数见表2。
表2MRM参数
化合物
模式
母离子
(m/z)
子离子
(m/z
锥孔电
压(y)
碰撞电压
(v)
ES-
321.0
152.0*
26
16
氯霉素
321.0
194.0
26
10
氯霉素-D5
326.1
157.0*
26
16
甲硝唑
ES+
172.0
172.0
82.0
128.0*
22
22
23
14
甲硝唑-D4
176.0
128.0*
22
16
备注：*为定量离子
3.2前处理方法
3.2.1样品的制备及保存
对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，
置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，将样品全部融化后搅匀，冷却至室温。
分出0.5kg作为试样，制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。
3.2.2试样保存
将试样于常温下保存。
3.2.3试样的前处理
称取蜂蜜5.00g(精确至0.01g)于50mL离心管中，分别加入40μL100ng/mLD5-氯霉素、D4-甲硝唑应用液，加水5mL,混匀溶解，再加入10mL乙腈，涡旋混匀，超声30min,10000rpm离心10min,吸取上层乙腈5mL入10mL试管。将5mL待净化液直接上样C18和NH?双层复合固相萃取柱，接收全部流出液，将接出的
流出液40℃水浴条件下氮吹至近干，用水定容至1mL,过膜，上机测定。
4.验证内容
4.1标准曲线、检出限、定量限
按照实验需要用乙腈/水(体积比1::1)配制1.0-50.0μg/L的混合标准系列
内标浓度为2.0μg/L。临用现配。
取样量按5.00g计算，以定性离子通道中3倍信噪比(S/N)对应的浓度为
方法定性限，10倍信噪比(S/N)对应的浓度为方法定量限。
标准曲线、检出限和定量限结果列于附表。
4.2回收加标实验
向样品中加入已知量的标准溶液和内标溶液，制备低、中、高三个加标浓度的样品(n=6),室温放置过夜后按照3.2样品前处理方法进行样品前处理，后
上机测定，计算回收率和精密度(n=6)。结果列于附表。
4.3参考样测定
准确称取蜂蜜参考样2.50g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入40μL100ng/mL氯霉素-D5、甲硝唑-D4的混合使用液，加水2.5mL,混匀溶解，再加入10mL乙腈，