利用谷氨酸棒状杆菌高效表达枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶发酵.PDF

第３８卷第２期 南京师大学报(自然科学版) Ｖｏｌ３８ Ｎｏ２ ２０１５年６月 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＮＡＮＪＩＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ(Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ) Ｊｕｎｅꎬ２０１５ 利用谷氨酸棒状杆菌高效表达枯草芽孢杆菌的 － 谷氨酰胺合成酶发酵生产Ｌ 谷氨酰胺 白　 婧ꎬ吴桐思雨ꎬ王　 期ꎬ殷志敏 (南京师范大学生命科学学院ꎬ生物化学与生物制品研究所ꎬ江苏省分子医学重点实验室ꎬ江苏 南京 ２１００２３) － [摘要]　 谷氨酰胺合成酶(ＧＳ)是用于合成Ｌ 谷氨酰胺(Ｌ￣Ｇｌｎ)过程中的关键酶ꎬ然而ＧＳ的酶活受到多种因素的 影响ꎬ导致其酶活不强ꎬ产物Ｌ￣Ｇｌｎ偏低. 本研究以ＧＳ 的基因为研究对象ꎬ构建谷氨酸棒状杆菌(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ)的高效表达系统. 利用Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ 中的两种强启动子:ｔａｃ启动子(Ｐｔａｃ)和麦芽糖启动子(Ｐｍａｌ)ꎬ比 较不同启动子的作用下ＧＳ的酶活力ꎻ其次ꎬ为了避免腺苷酰化对Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ的ＧＳ的抑制作用ꎬ将ＧＳ 的腺苷酰 化位点突变成苯丙氨酸(Ｔｙｒ４０５Ｐｈｅ)ꎻ同时由于枯草芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)的ＧＳ不受腺苷酰化作用的影响ꎬ故 将Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 的ＧＳ基因导入到Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ的表达系统中ꎬ比较两种基因来源不同ＧＳ 的酶活高低ꎬ以期达 到高产Ｌ￣Ｇｌｎ的目的.本研究第一次应用Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ来源的ＧＳ在Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ的系统中表达. 最终的结果表 明ꎬ在Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ的表达系统中ꎬＰｔａｃ 比Ｐｍａｌ 的效果更好ꎬ来自Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ 的ＧＳ 比来自Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ的ＧＳ 酶活力更高. 重组菌ＢＪ２有最高的酶活力和产量ꎬＬ￣Ｇｌｎ的最终产量达到３２.５ｇ/ Ｌ. [关键词]　 谷氨酸棒状杆菌ꎬｔａｃ启动子ꎬｍａｌ启动子ꎬ谷氨酰胺合成酶 － － － [中图分类号]Ｑ７８９　 [文献标志码]Ａ　 [文章编号]１００１ ４６１６(２０１５)０２ ００７８ ０８ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｉｓ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｌ￣Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ＢａｉＪｉｎｇꎬＷｕＴｏｎｇｓｉｙｕꎬＷａｎｇ ＱｉꎬＹｉｎＺｈｉｍｉｎ (Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓꎬ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００２３ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ(ＧＳ)ｉｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｌ￣ｇｌｕｔａｍｉｎｅ(Ｌ￣Ｇｌｎ)ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＧＳ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｍａｎｙ ｆａｃｔｏｒｓꎬｌｅａｄｉｎｇ