免疫磁捕获实时荧光PCR快速检测鸡肉中沙门氏菌.doc

免疫磁捕获-实时荧光 PCR 快速检测鸡肉中沙门氏菌* 张东方1，2 ，袁飞1 ，王娉1 ，胡玥1 ，陈颖1 ，葛毅强2，3 1( 中国检验检疫科学研究院，北京，100123) 2( 中国农业大学食品学院，北京，100083) 3( 中国农村技术开发中心，北京，100045) 摘 要 对免疫磁捕获-实时荧光 PCR 检测鸡肉中沙门氏菌进行了初步研究。主要包括免疫磁珠制备条件的选 择及优化，通过实验最终确定了以 6 mg / mL EDC 和 5 mg / mL NHS 活化直径为 700 nm 的羧基聚苯乙烯磁性微 球，与浓度为 100 μg / mL 的沙门氏菌抗体在 37℃ 振荡孵育 1. 5 h，制备得到抗沙门氏菌免疫磁珠，与市售沙门氏 菌免疫磁珠试剂盒( Dynal 产品) 捕获效率相当。免疫磁捕获-实时荧光 PCR 检测方法检测限为 104 CFU / mL 左 右，能在 16 h 内检测出鸡肉中 104 CFU / mL 的沙门氏菌，可用于食品中沙门氏菌的快速检测。 关键词 沙门氏菌，免疫磁捕获法，实时荧光 PCR，检测 沙门氏菌属( Salmonella spp. ) 常存在于肉制品、 蛋、奶类等畜禽产品中，是最常见的人畜共患的病原 菌之一，根据国际食源性病原菌所致危害的严重性， 沙门氏菌被列为首选控制的食源性致病菌［1］。目前 沙门氏菌的检验多采用传统的检测方法、PCR 方法 及实时荧光 PCR 法等。传统的检测方法一般需要 5 ～ 7 d，周期长，过程繁琐; PCR 方法及实时荧光 PCR 方法，虽然操作简单，但需要待检样品中菌体达到较 高浓度。免疫磁珠( Immunomagnetic Beads，IMB ) 具 有选择性好，特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用， 有效避免或减少漏 检，且 可 去 除食品样品中抑制 PCR 扩增的成分。已有学者利用免疫磁珠结合传统 显色培养法、酶联免疫或普通 PCR 等方法进行沙门 氏菌检测，仍存在耗时长，操作复杂等问题［2 － 3］。本 研究优化了沙门氏菌免疫磁珠制备条件，建立了沙门 氏菌免疫磁捕获-实时荧光 PCR 快速检测方法，利用 该方法检测了人工污染沙门氏菌鸡肉样品，并对比了 自制免疫磁珠与免疫磁珠试剂盒的捕获效率。 猪霍 乱 沙 门 氏 菌 ( IQCC10502 ) 、病 牛 沙 门 氏 菌 ( IQCC10510) 、肯塔基沙门氏菌( IQCC10530 ) 、布伦 登卢 普 沙 门 氏 菌 ( IQCC10542 ) 、伤 寒 沙 门 氏 菌 ( IQCC10593) 、肠炎沙门氏菌( IQCC10512 ) 、鸭沙门 氏 菌 IQCC10509 ) 、 山 夫 登 堡 沙 门 氏 菌 ( ( IQCC10520) 、阿伯丁沙门氏菌( IQCC10511 ) 、旺兹 沃斯沙门 氏 菌 ( IQCC10515 ) ，对 照 菌 株 ( 大 肠 杆 菌 IQCC10103) 均来源于中国检验检疫科学研究院菌种 保藏中心( IQCC) 。 1. 1. 2 样品 鸡胸肉，购自北京市场。 1. 1. 3 主要仪器与设备 微量移液器( 10 μL，100 μL，200 μL，1 000 μL， 德国 Eppendorf 公 司) ; 实 时 荧 光 定 量 PCR 扩 增 仪 ( Mastercycler ep realplex，德国 Eppendorf 公司) ; 电泳 仪( DYY-6C，北京六一仪器厂) ; 凝胶成像仪 ( Gene Genius) ; 倒置生物显微镜( DMI3000B、DM6000B，德 国 LEICA 公司) ; 全波长酶标仪( Multiskan Spectrum， 美国 Thermo 公司) ; 全自动微生物分选仪( BeadRe- trieverTM ，美国 Invitrogen 公司) ; 磁力架 ( Promega 12 well magnetic seperator) 。 1 1. 1 材料与方法 实验材料 实验菌株 1. 1. 4 主要试剂 1. 1. 1 脑心浸液肉汤( BHI) ( 美国 Difico 公司) ; 营养琼 脂( 北京陆桥公司) ; API20E( 法国生物梅里埃公司) ; 沙门氏菌标准菌株( ATCC14028 ) ，12 株 A-F 群 O 价 沙门氏菌分别 为: 甲型副伤寒沙门氏菌 ( IQCC10518) 、乙型副伤寒沙门氏菌( IQCC10504 ) 、 核壳式聚苯乙烯羧基化磁性微球 ( 0. 5% ，100 nm、 700 nm、3 μm、5 μm) ( 天津倍思乐色谱技术开发中 心) ; 碳二亚胺( EDC) ( 上海共价化学) ; N-羟基琥珀 酰亚胺 ( NHS ) ( 上 海