第五章 核酸药物的分离.ppt

4、电场强度的影响 低电压下，DNA迁移率与电压成正比 电压增大时，不同大小、结构和电荷量的DNA片段的迁移率增大的比例不同 故其分离范围也是不同的 * 第五章 核酸药物的分离 5.2核酸药物分离 分离核酸的原则 1 保持核酸分子一级结构的完整性 2. 防止核酸的生物降解 2 分离提取核酸的主要步骤 2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存 5.2.1盐析法及沉淀法 特点：应用广，设备简单，沉淀易于过滤 原理： 1破坏了核酸和蛋白质分子间的氢键和盐键，从而分开 2利用试剂选择性的沉淀蛋白质分子，和浓缩核酸，从而分离 大分子物质沉淀原理 1，盐离子与大分子物质表面的反电性基团结合，形成了离子对，中和了部分电性，大分子物质电性降低，排斥力降低，从而聚集沉淀 2，盐离子破坏大分子物质的水化膜，暴露疏水基团，其相互作用，沉淀 3，有机试剂的水合作用，降低水自由度，消弱了大分子物质表面的水化膜，疏水作用加强，沉淀 4，有机溶剂降低了溶质分子即大分子物质的介电常数，分子间静电力增强，沉淀（书列） 酚：氯仿抽提法 细胞裂解后离心 水相中加入等体积的酚：（氯仿+异戊醇)[25:(24+1)] 振荡混匀 离心 上层水相(为何在水相？)用70%乙醇洗得较纯的核酸 5.2.2离心法 地位：应用广泛，生物制药中必不可少 核酸分离与其他方法配合使用，非核心步骤。 密度梯度离心法： 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带 速率区带离心: 将样品置于一密度梯度介质(如蔗糖、甘油、聚蔗糖等)顶层，该梯度最大密度低于拟分离混合物的最小密度，离心时各物质(细胞、细胞器、分子等)按其大小、形状和密度的不同而沉降速率各异，分别沉降在不同区带而达到分离的方法。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。 预制梯度等密度离心法。 要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离 自成梯度等密度离心法。 某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离 梯度液的制备 选择原则 1，对被分离物质无作用 2，溶液中稳定存在 3，在使用范围内，粘度小，渗透压低，离子强度与ph值变化小 4，易与被分离颗粒分开 5，对离心机五腐蚀作用 6，便于浓度的测定 5.2.3膜分离 孔径范围（0.001~10um),涵盖了透析，微滤，超滤等技术 特殊性质:一定条件下硝酸纤维素酯滤膜和MF-(混合)纤维素酯滤膜能结合蛋白质（与离子强度无关）、单链DNA（与离子强度有关） 应用 蛋白质—DNA络合物的测定及纯化受体的测定 mRNA的纯化和测定 环状DNA的纯化 ATP辅酶的除菌 5.2.4离子交换色谱 以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 离子交换剂是一类能显示离子交换的功能高分子材料。是由基质（纤维素、葡聚糖、琼脂糖）、电荷基团（功能基团）和反离子构成。（书） 为何核酸会带上电荷？ 核苷酸存在着解离度，其大小随着ph的变化而变化 巨核苷酸由四种碱基按不同序列沿戊糖—磷酸链排列，此种结构具有高度的亲水性，且富含阴离子，所以一般核酸是带负电的 固定相：阳离子基团 流动相：缓冲液 载体：惰性的高分子化合物 DNA在固定相上的保留因素 固定相的交换容积 交换基团的电荷密度 流动相的ph 盐的的组成及离子强度 DNA本身的因素（分子大小、碱基种类、排列的顺序） 应用： 分离已知的单链据核苷酸 分离RNA 分离大小不等的DNA片段 分离完整的DNA 核苷酸 第一磷酸基 pKa1 第二磷酸基 pKa2 含氮环的亚氨基（－NH? =） pKa3 等电点 pI值* UMP GMP AMP CMP 1.0 0.7 0.9 0.8 6.4 6.1