RH034调控拟南芥雌配子发育的研究.pdf

摘要

雌配子体是开花植物有性生殖过程中的特殊结构，成熟的雌配子体首先经过孢子体

发育形成功能性大孢子，之后经过配子体发育形成一个多细胞结构特化的配子体，雌配

子体经受精作用形成胚和种子，使得植物体完成生命周期交替。雌配子体的发育是一个

复杂的过程，该过程涉及有丝分裂、细胞化、细胞分化和细胞凋亡等多种生命活动。目

前研究已发现多种参与调控雌配子体发育的途径，其中包括DEAD-BoxRNA解旋酶参

与的调控。探究雌配子体发育调控机制可为了解植物育性机制研究及育种等工作提供理

论依据。

课题组前期通过rh034突变体的研究发现DEAD-BoxRNA解旋酶RH034是雌配子

体发育所必需的，但rh034突变等位基因是强突变体，具有致死效应，限制了对RH034

在雌配子体发育和其他生长发育过程中功能的更多了解。本论文工作获得了rh034突变

体的弱互补株系，以此作为RH034的敲低（knock-down）材料，通过表型观察和蛋白

互作验证等方法进一步研究RH034在雌配子体发育中的功能，主要取得以下结果：

1.RH034参与调控雌配子体发育

先前研究发现rh034杂合突变体育性严重下降，且后代无法分离获得纯合突变体。

本研究中延迟授粉实验表明rh034突变等位基因完全不能通过雌配子传递，进一步证实

雌配子体发育存在强缺陷。构建了植物表达载体RH034p::RH034-HA，并通过农杆菌转

化获得了rh034突变等位基因的纯合互补株系，表明其中rh034突变体配子体传递功能

恢复；结实数目统计表明rh034互补株系育性仅得到部分恢复，因此这些植株为RH034

的敲低材料。通过CLSM观察rh034互补株系雌配子体，发现了与rh034杂合突变体类

似的缺陷：雌配子体液泡发育受损、细胞核数量和位置异常以及有丝分裂延迟。进一步

的发育时期统计显示rh034互补株系雌配子体发育同步性部分受损，表明RH034参与雌

配子体有丝分裂进程调控。此外，还观察到rh034互补株系雌配子体孢子体发育时期的

多胚珠分支和珠被异常现象。这些结果表明RH034参与调控雌配子体的液泡化、有丝

分裂、核迁移、细胞程序性死亡、珠被的发生及调控等过程。RH034和已知定位在核仁

I

的RH36的亚细胞共定位显示RH034定位在核仁上。转基因植株RH034p::GUS的GUS

染色表明RH034在拟南芥的花器官普遍表达，其中在雌配子体的珠心表达量较高。

2.RH034参与调控胚珠原基干细胞稳态

已有研究表明rh27纯合突变体茎尖干细胞稳态被破坏，同源结构域转录因子

WUSCHEL（WUS）的表达模式受到影响，导致植株呈抽薹时多分枝表型。营养生长时

期表型观察发现，rh034互补株系出现多分枝的表型，类似rh27纯合突变体。采用报告

基因WUSpro::GFP:GUS对rh034互补株系胚珠原基进行GUS活性分析，显示rh034互

补株系的WUS表达强度和一致性改变，表明RH034参与调控胚珠原基干细胞稳态。BiFC

和酵母双杂交显示RH034和RH27存在互作，暗示RH034和RH27共同参与调节拟南

芥干细胞稳态。

3.RH034参与拟南芥18Spre-rRNA的加工

构建了雌二醇诱导型的RNAi载体pER10-034Ri，获得了其转基因株系。实时荧光

定量PCR显示034Ri株系中RH034的表达量显著下降，并且18SrRNA前体5端外部

转录序列（5ETS）和内部转录序列1（ITS1）的水平提高，表明RH034参与rRNA前

体加工。

关键词：DEAD-BoxRNA解旋酶，雌配子体，胚珠原基，干细胞平衡，CLSM

II

ABSTRACT

Thefemalegametophyteisaspecialstructureintheprocessofsexualreproduction