分子生物学-核酸-讲义.ppt

* 问题与讨论： １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。 ２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。 3. 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？ * 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 * * * * * * * * * 2.8.1 核酸的提取 DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。 DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液而不溶于0.14mol/L NaCl溶液。 RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl溶液的性质，先提取得到RNP。 提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。 2.8 核酸的提取分离 * 2.8.2 核酸的分离纯化 1.粗分级分离 从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸类等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。 粗提纯中，进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。 从RNA除去混杂的DNA，可用DNAase将DNA降解掉。 从DNA中除去混杂的RNA，可用RNAase将RNA降解掉。 * 核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。 超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。 电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。 2.精分级分离 * 核酸的纯度鉴定 核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳、沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。 * 纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0， 若DNA高于1.8，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染 。 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。 * 2.8.3 核酸的超速离心(ultracentrifugation) 离心机分类：普通 6000rpm 高速 20000-25000rpm 超速 30000-80000rpm 平衡 * 2.8.4 核 酸 凝胶电 泳 （一）DNA的凝胶电泳 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片段就能分开 * 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 * bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C