基于秀丽隐杆线虫生殖毒性检测技术规范.docx

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基于秀丽隐杆线虫生殖毒性检测技术规范

1范围

本标准规定了单一或混合性化学品对秀丽隐杆线虫生殖毒性实验的术语和定义、秀丽隐杆线虫品

系和细菌、操作方法、结果观察和结果判定。

本标准适用于评估不具有腐蚀性的单一或混合性化学品对秀丽隐杆线虫生殖毒性的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中标注日期的引用文件，仅所标注日期的版本适用于本文件。未标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）

适用于本文件。

2.1GB15193.15-2015食品安全国家标准生殖毒性试验

2.2GB15193.29-2020食品安全国家标准扩展一代生殖毒性试验

2.3GB/T21766-2008化学品生殖/发育毒性筛选试验方法

2.4GBZ/T240.22化学品毒理学评价程序和试验方法：两代繁殖毒性试验

2.5GB/T35517-2017化学品鱼类生殖毒性短期试验方法

2.6GB/T35522-2017化学品土壤弹尾目昆虫生殖试验

2.7ASTME2172-2001(2014)利用秀丽隐杆线虫进行实验室土壤毒性试验的标准指南

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1后代数（broodsize）

将染毒后并发育到年轻成虫期(Youngadult)的秀丽线虫随机挑出30条分别放入新配置的加有2.5μLOP50（大肠杆菌）的直径3cmNGM培养基上，将处于成虫期的的线虫每24h转一次板，观察进入产卵期后每天的产卵数量动态变化直至线虫不再产卵，36h后分别计数每块板中线虫的数量，合并求和后为后

代数的值。

3.2世代时间(generationtime)

于显微镜下观察，将P0代线虫产第一只卵的时间记为T1，产的第一只卵成熟后进入产卵期后，所产

的第一只卵记为T2，T2-T1的时间记为世代时间。

3.3瞬时产卵率(ovulationrate)

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染毒后发育到年轻成虫期(Youngadult)雌雄同体线虫继续培养24h后每个剂量组挑30条到新的培养

皿中，4h后将线虫挑出，计数虫卵数目，计算每小时平均产卵率，即为瞬时产卵率。

3.4生殖系统畸形率(abnormalitiesofreproductivesystem)

将染毒后发育到年轻成虫期(Youngadult)雌雄同体线虫置于滴有M9缓冲溶液的载玻片上，采用1mM盐酸左旋咪唑麻醉，至于显微镜下观察并拍摄照片。生殖系统的畸形包括排卵孔凸出、无排卵孔、子宫内小受精卵、性腺发育异常、无卵和虫袋等类型。每组观察100条线虫，计算发生不同畸形表型的

线虫百分比。

生殖系统畸形率=生殖系统各畸形表型数/100

3.5-2卵母细胞

卵母细胞是指线虫单侧性腺臂远端loop区到性腺臂近端纳精囊之间的细胞，纳精囊旁第二个终变期

卵母细胞即为-2卵母细胞。

4秀丽隐杆线虫品系和细菌

4.1N2线虫（雌雄同体线虫），DR466:him-5(e1490)（雄性个体代表），CB4108:fog-2(q71)（雌性个体代表）品系，源自秀丽隐杆线虫遗传中心（CaenorhabditisGeneticCenter,CGC）()

4.2大肠杆菌菌株EscherichiacolistrainOP50，由线虫实验室保存。

5秀丽隐杆线虫发育周期与生殖系统示意图

图1雌雄同体线虫发育周期示意图

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Fig.1Schematicdiagramoflifecycleofhermaphroditenematodes

a/hermaphrodite/introduction/Introframeset.html

b注：秀丽隐杆线虫能在16℃~25℃之间生长，适宜温度为20℃,秀丽隐杆线虫在25℃时的生长速度是16℃时的2.1倍，在20℃时的生长速度是16℃时的1.3倍。

秀丽隐杆线虫产卵后，20℃下培养，大约经9h卵孵化成体长大约250μm的小虫，此为L1期秀丽隐杆线虫。若族群拥挤或食物不足时，L1期秀丽隐杆线虫会进入另一种幼虫期，叫做Dauer幼虫，Dauer期幼虫能对抗逆境，而且不会老化可维持数月之久，若提供丰富的食物，Dauer期可快速进入L4期。若食物丰富，大约经12h，L1期秀丽隐杆线虫生长发育为360μm-380μm的L2期秀丽隐杆线虫；大约经8h，L2期秀丽隐杆线虫生长发育为490μm-510μm的L3期秀丽隐杆线虫；大约经8h，L3期秀丽隐杆线虫生