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乳酸杆菌表达系统的研究进展 乳酸杆菌表达系统的研究进展 乳酸杆菌表达系统的研究进展 丁 轲 程安春 (四川农业大学动物科技学院 四川雅安 625014) 乳酸杆菌是一种常见的益生菌，它的应用已有几百年的历史，是一种公认的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。该菌广泛存在于人、动物和植物中，可以产生多种物质，如短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、蛋白质和各种酶类等。尤其重要的是它是人和动物肠道中最重要的优势菌群之一，对于机体的代谢、免疫调节等方面起着极其重要的作用。但随着基因工程技术的发展日趋完善，人们已不再满足于乳酸杆菌自身固有的功能，特别是当前由于疫苗免疫和菌(毒)株的残留毒力之间的矛盾，促使人们寻求能良好表达外源抗原且安全的疫苗载体候选菌株，乳酸杆菌便自然成为最佳选择菌株之一，因此近年来在疫苗载体的研究中日益受到重视，但其研究却远远落后于病原微生物。现就这一方面作一综述。 1 乳酸杆菌表达载体的优点 乳酸杆菌作为表达载体有许多独特的优势，这主要是因为乳酸杆菌是人和动物体内最优势的益生菌株之一，许多研究都表明它的有无和多寡都对机体有着至关重要的影响，以它为表达系统有其它菌株不可比拟的优点，主要表现在以下方面：①乳酸杆菌是至今发现的唯一没有致病性的一个种；②它在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统，较其它菌株更易达到较高的表达量；③若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的食品提供了可能；④乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；⑤乳酸杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的蛋白；⑥乳酸杆菌可直接口服，能够耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，这样就免去了目的蛋白的体外提纯等后加工。 2 乳酸杆菌质粒 1976年Chassy[1]首先发现乳酸杆菌中存在质粒，质粒在不同的乳酸杆菌中分布不均，Vescovo等[2]对159株乳酸杆菌进行质粒抽提，发现L. reuteri、L. helveticus 和L. acidophilus含质粒的比率较高，分别为63%、27%和20%，L. casei仅有4%的菌株含有质粒，L.plantarum、L. brevis 和L. coryniformis没有发现质粒。Mckay等[3]研究表明约有38%的乳酸杆菌中含有质粒，大小约在1.2kb~150kb之间，且数量各异。经研究表明乳酸杆菌质粒具有如下特点： (1)大多数乳酸杆菌质粒均为隐蔽型质粒，但现已证明某些乳酸杆菌的细菌素、与糖代谢有关的酶及抗生素抗性等都是由不同质粒所决定[4-5]，现已由来自乳酸杆菌隐蔽型质粒构建了许多携带乳酸杆菌复制子的质粒载体；(2)乳酸杆菌质粒具有分离稳定的特点；(3)乳酸杆菌中较小的质粒拷贝数高，一般可达30~50个。（4）很多乳酸杆菌质粒的复制子具有广泛宿主范围，可在不同种类的菌株之间同时进行复制，这就避免了专一性质粒在菌株之间使用时不要进行的亚克隆，如pW425e就可同时在乳酸杆菌和大肠杆菌中表达。(5)不同来源的乳酸杆菌质粒具有差异性，研究表明来自鸡、猪、小鼠等动物肠道中乳酸杆菌，质粒阳性菌株较少，而来源于橄榄的乳酸杆菌中均发现有不同大小的质粒存在；(6)乳酸菌属的某些菌株(如乳酸乳球菌)的质粒也可作为乳酸杆菌的质粒，如由具有广泛宿主范围的载体乳酸乳球菌质 粒pGK12构建出许多的乳酸杆菌基因转化系统；(7)一些乳酸杆菌质粒没有宿主特异性，如pIP501、pKP825和pLPE323适用于广泛宿主范围，因而它们可在许多不同种类乳酸杆菌中进行增殖，而且它们在不同种类乳酸杆菌中的扩增拷贝数并没有明显不同，这说明其在不同宿主菌中的DNA复制调控机制是相似的。现已有多种乳酸杆菌质粒被提出并鉴定，如表1所示。 3 乳酸杆菌质粒基因表达调控 由于乳酸杆菌的质粒大多是隐蔽型的，因此对乳酸杆菌基因转录和翻译的调控及蛋白质分泌的机制还不甚了解，这可能也是乳酸杆菌分子生物学研究滞后的原因。但随着基因工程技术的发展，已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件，通过对部分质粒DNA序列的测定，然后再同已知序列的质粒的基因进行比较来推测未知质粒部分基因的功能，相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体、整合载体。经过研究发现乳酸杆菌质粒基因中普遍存在两种调控序列，一种是与基因复制起始相关的序列，主要包括两大类：一类是编码蛋白的开放阅读框架ORF，是复制相关蛋白的核酸序列，在乳酸杆菌中这些与质粒复制相关的