琼脂糖凝胶电泳试验课件.ppt

琼脂糖凝胶电泳技术 实验三 三、实验原理 影响核酸电泳的因素 1）核酸的性质 核酸的电荷量、分子大小、分子空间构象决定了不同核酸分子具有不同的迁移率。 线性双链DNA分子，分子量的常用对数与泳动率呈反比关系；而分子的空间构象影响影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA的迁移速率则是：闭环型线性单链开环型。 其他结构如：(A)单链RNA或单链DNA的分子内局部配对； (B) 与 蛋白质结合的DNA复合体 2）凝胶孔径大小 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。 作 业 1. 将实验内容和结果填写在实验报告本上。 2. 琼脂糖电泳原理是什么？ 3. 在琼脂糖凝胶电泳过程中有哪些因素会影响电泳结果？ 谢谢！请大家开始分组实验 * * 一、实验目的 学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。 二、材料、试剂和仪器 材料：质粒、银杏DNA 试剂：DL2000 Marker、琼脂糖、50×TAE electrophoresis buffer、6×loading buffer、EB贮存液 、双蒸水 仪器：电泳仪、微波炉、成像系统、电子天平、移液器、一次性薄膜手套、量筒、烧杯、三角瓶、吸头等 概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约200bp~50kb。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点后再冷却凝固就形成良好的电泳介质，其孔径决定于其浓度。电泳介质中的孔径对电泳迁移中的带电分子产生一种阻力，阻力的大小取决于带电分子的大小及其物理性状。 在生理条件下，核苷酸的磷酸基团是带负电荷的，所以DNA分子是多聚阴离子，在电场中向正极迁移。 DNA分子带电量与其大小成正比的。 在一定电场强度下，若无任何介质阻碍迁移，则大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在实际电泳中，由于使用了琼脂糖分子筛介质，对大分子DNA产生了较强的阻力，因此大分子DNA尽管有较高的带电量，仍难以快速前进；小分子DNA由于能够穿越介质网孔，其带电量尽管相对较小，但仍能快速迁移到正极。因此，不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中产生了不同的迁移距离，这种迁移距离的差异使得不同大小DNA得以分离。 核酸迁移率的影响因素： 40~200 12.0 25~150 15.0 60~400 8.0 6~100 20.0 80~500 5.0 100~2000 ( bp) 3.5 PAG 0.1~3 2.0 0.2~4 1.5 0.4~6 1.2 0.5~7 0.9 0.8~10 0.7 5~60 ( kb) 0.3 琼脂糖 线状DNA分子的有效分离范围 胶浓度（%） 凝胶 不同（空间）类型核酸的凝胶电泳： 单链RNA或单链DNA——变性胶电泳：在缓冲液和凝胶中加入尿素或甲醛等核酸变性剂，使分子内配对结构打开，使其带电量和分子形状无关，仅与分子大小有关。 质粒（具有高级结构的DNA）——一般的琼脂凝胶电泳；但由于结构的不同可能会出现不同的条带。 比较大的DNA分子——脉冲式电泳 与蛋白质结合的DNA复合体——凝胶电泳阻滞分析（electro-mobility shift assay , EMSA）。 3）电场强度和电场方向 低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。 对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。 可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。 4）电泳环境 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需